Diese Technik der Herstellung von Influenza-Virus PP und der Bestimmung seiner Infektiosität kann die Erforschung des Influenzavirus in einer BSL-2-Stadt vereinfachen. Wir normalisierten die PPS für die Infektionen basierend auf qRT-PCR-Daten von PPS. Zwei Glykoprotein-Expressionsplasmide sind kodiert, was die Forschung über die Neusortierung von Viren vereinfachen kann.
Überprüfen Sie einen Tag nach der Zellaussaat die Zellmorphologie und -dichte unter einem invertierten Lichtmikroskop. Idealerweise sollte die Zelle bei der Transfektion ca. 85% konfluent sein. Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter serumfreies DMEM pro Brunnen und legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
Für jeden zu transfizierten Zellbrunnen acht Mikroliter des Transfektionsreagenzes auf ein Volumen von 150 Mikrolitern mit reduziertem Serummedium verdünnen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten sitzen. In der Zwischenzeit verdünnen Sie 2,5 Mikrogramm Plasmid-DNA in 158 Mikroliter reduzierten Serummediums.
Nach der fünfminütigen Inkubation die verdünnte DNA mit verdünntem Transfektionsreagenz kombinieren, die Lösung vorsichtig mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur lassen. Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu den entsprechenden Brunnen mit den Zellen in serumfreiem Medium hinzu. Dann mischen Sie die Platte sanft, indem Sie hin und her schaukeln.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier bis sechs Stunden. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter DMEM pro Brunnen. Dann inkubieren Sie es für weitere 36 bis 48 Stunden.
Samen jeder Art von anfälligen Zelle bei 10 000 Zellen pro Brunnen und eine 96 Well Platte. Dann lassen Sie die Platte über Nacht in einem 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator. Überprüfen Sie am dritten Tag nach der Transfektion die Farbe des Mediums, das rosa oder leicht orange leuchten soll, und untersuchen Sie die Zellen mit einem invertierten biologischen Mikroskop unter 440 bis 460 Nanometer Wellenlänge.
Nach 38 bis 48 Stunden nach der Transfektion die pseuotypisierten Partikel oder PPS ernten, indem Sie sie durch einen 0,45 Mikrometer Polyvinyliden-Fluorid-Membranfilter passieren, um Zellablagerungen zu beseitigen, sie dann in kleine Mengen aliquots aufzuteilen und sie bei minus 80 Grad Celsius zu speichern. Zur Quantifizierung des PPS 30 Mikroliter der gereinigten Viruspartikel in ein 1,5 Mikroliter RNase-freies Rohr übertragen und einen Mikroliter Benzonase-Nuklease hinzufügen. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um jegliche DNA- und RNA-Kontamination zu beseitigen.
Nach der Inkubation die Probe auf minus 70 Grad Celsius einfrieren, um die Nuklease zu aktivieren und zwei Mikroliter Proteinase K.Inkubieren Sie die Mischung für 30 Minuten, um die Hüllproteine zu verdauen und die CMV-GFP-RNA freizusetzen. Dann inaktiv die Proteinase K bei 100 Grad Celsius für drei Minuten. Quantifizieren Sie die PPS mit quantitativer Reverse-Transkription RTPCR mit dem Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit in den primern und sonden im Textmanuskript angegeben.
Normalisieren Sie die PPS auf viermal 10 bis 5 RNA-Kopien pro Milliliter. Fügen Sie dann TPCK-Trypsin zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in das PPS, das H7N9-Hemagglutinin beherbergt. Inkubieren Sie das PPS bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die funktionalen Untereinheiten HA1 und HA2 zu bilden.
Mischen Sie die normalisierten PPS mit DMEM-Medium im Verhältnis eins zu eins, und bringen Sie dann die Platte mit anfälligen Zellen in den Biosicherheitsschrank. Den Überstand ansaugen und die Zellen einmal mit 100 Mikrolitern vorgewärmtem PBS waschen. Fügen Sie 100 Mikroliter PPS-DMEM-Mischung in jeden Brunnen, dreifache Infektiositätstests jeder Art von PPS zu einer anfälligen Zelllinie.
Inkubieren Sie die Platte für vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Dann den Überstand ansaugen und durch 100 Mikroliter DCM-Inkubation ersetzen, die Platte noch 24 bis 36 Stunden vor der Infektiositätserkennung. Unsere Ergebnisse sind PPS gelten jetzt als ansteckend für die Menschen.
Daher werden notwendige Sicherheitsvorkehrungen empfohlen, wie das Tragen einer Maske und die Durchführung der Infektiositätstests in einem Biosicherheitsschrank. Dieses Protokoll wurde erzeugt, um 10 Arten von pseudotypisierten Partikeln oder PPS mit zwei gruppierten Hemaglutinin und Neuraminidase vesikuläre stomatitis Virus G G Glycoprotein oder keine Hüllhaut Glycoproteine zu generieren. Die PPS wurden mit Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet und ihre Infektiosität wurden in zwei Zelllinien, A549 und MDCK, bewertet.
In der PPS-Gruppe, die H5 beherbergt, betrug die Infektiosität von H5N1, H5 plus N9 und H5 etwa 90%18% bzw. 10% für die Zelllinie A549 bzw. 40%5% bzw. 5% für MDCK. In der PPS-Gruppe, die H7 beherbergt, betrug die Infektiosität von H7N9, H7 plus N1 und H7 etwa 10%7% bzw. 1% für die Zelllinie A549 bzw. 8%4% bzw. 1% für MDCK. Die Infektiosität des vesikulären Stomatitisvirus G G Glycoprotein PP betrug etwa 21% für A549 und 16% für MDCK-Zellen.
Während die Delta-Hüllkurve Glykoproteine PP zeigte keine Infektiosität. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der PP-Produzent HEK-293T/17 Zellen bilden die Grundlage dieses Verfahrens. Das optimale Wachstum lehrt uns also HEK-293T/17 Zellen.
Nach diesem Verfahren oder einem anderen Test, wie z. B. L2-Empfängnis, kann der Begrenzungstest durchgeführt werden. Dieser Assay kann fast die biologischen Besonderheiten der Rezeptorpräferenz loswerden und das Muster wird den Tropismus der PPS offenbaren. Da sie die Glykoproteine aus dem Influenzavirus genommen haben, werden sie in zwei plus max geklont.
HA und die NA-Proteine können getrennt untersucht werden, so dass wir zwischen ihnen neu zu sanieren. Die Mutanten und die reifen Effekte können erforscht werden.
