Этот метод производства вирусной ПП гриппа и определения его инфекционности может упростить исследование вируса гриппа в городе BSL-2. Мы нормализовали PPS для инфекций на основе данных qRT-PCR PPS. Кодируются два плазмида экспрессии гликопротеина, что может упростить исследование по повторному распространению вируса.
На следующий день после посева клеток проверьте морфологию клеток и плотность под перевернутым световым микроскопом. В идеале клетка должна быть примерно на 85% стечена при трансфекции. Замените носитель на один миллилитр без сыворотки DMEM на колодец и положите тарелку обратно в инкубатор.
Для каждой колодец клеток, которые будут трансфицированы, разбавить восемь микролитров трансфекции реагента в объеме 150 микролитров с пониженной среде сыворотки. Смешайте раствор осторожно и дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение пяти минут. Между тем, разбавить 2,5 микрограмма плазмидной ДНК в 158 микролитров уменьшенной среды сыворотки.
После пятиминутной инкубации смешайте разбавленную ДНК с разбавленным трансфектным реагентом, аккуратно перемешайте раствор и оставьте его при комнатной температуре на 15 минут. Добавьте липидный комплекс ДНК в соответствующие скважины с клетками в среде, свободной от сыворотки. Затем аккуратно перемешайте тарелку, качаясь взад и вперед.
Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе в течение четырех-шести часов. После инкубации удалите среду и замените ее двумя миллилитров DMEM на колодец. Затем инкубировать его в течение еще 36 до 48 часов.
Семя каждого типа восприимчивых клеток на 10000 клеток на колодец и 96 хорошо пластины. Затем оставьте пластину на ночь в 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа инкубатора. На третий день после трансфекции проверьте цвет среды, которая должна быть светло-розовой или слегка оранжевой, и изучите клетки с перевернутым флуоресцентным биологическим микроскопом под длиной волны от 440 до 460 нанометров.
На 38 до 48 часов после пост-трансфекции, урожай pseuotyped частиц или PPS, проехав их через 0,45 микрометра поливинидин фторид мембраны фильтр для устранения клеточного мусора, а затем разделить их на небольшой объем aliquots и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для количественной оценки PPS перенесите 30 микролитров очищенных вирусных частиц в 1,5 микролитера RNase-бесплатную трубку и добавьте один микролитер бензоразы Nuclease. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы устранить любое загрязнение ДНК и РНК.
После инкубации заморозить образец до минус 70 градусов по Цельсию, чтобы активировать нуклеазу и добавить два микролитров протеиназы K.Incubate смесь в течение 30 минут, чтобы переварить белки конверта и освободить CMV-GFP РНК. Затем неактивный Proteinase K при 100 градусах по Цельсию в течение трех минут. Количественная оценка PPS с количественной обратной транскрипцией RTPCR с использованием универсального зонда One-Step RT-qPCR Kit в праймерах и зондах, указанных в рукописи текста.
Нормализация PPS в четыре раза от 10 до пятой РНК копий на миллилитр. Затем добавьте TPCK-трипсин к окончательной концентрации 10 микрограмм на миллилитр в PPS, который гавани H7N9 гемагглютинин. Инкубировать PPS при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы сформировать функциональные подразделения HA1 и HA2.
Смешайте нормализованную PPS со средой DMEM при соотношении один к одному, а затем принесите пластину, содержащую восприимчивые клетки, в шкаф биобезопасности. Аспирировать супернатант и мыть клетки один раз с 100 микролитров предварительно разогретых PBS. Добавьте 100 микролитров смеси PPS-DMEM в каждую колодец, в трижды урезав тесты инфекционности каждого типа PPS на одну восприимчивую линию клеток.
Инкубировать пластину в течение четырех-шести часов при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Затем аспирировать супернатант и заменить его 100 микролитров DCM инкубировать пластину еще за 24 до 36 часов до обнаружения инфекционности. Наши результаты PPS считаются в настоящее время инфекционными для людей.
Поэтому необходимые безопасные процедуры охраны рекомендуется принимать, такие как ношение маски и выполнение анализа инфекционности в кабинете биобезопасности. Этот протокол был создан для создания 10 типов псевдотипизированных частиц или PPS с двумя сгруппированными гемаглютинин и neuraminidase везикулярный стоматит вирус G гликопротеин или нет конверт гликопротеинов. PPS были изображены с помощью электронной микроскопии передачи, и их инфекционность была оценена в двух клеточных линиях, A549 и MDCK.
В группе PPS, укрывя H5, инфекционность H5N1, H5 плюс N9 и H5 составила примерно 90%18% и 10% для клеточной линии A549 и 40%5% и 5% для MDCK, соответственно. В группе PPS, укрывя H7, инфекционность H7N9, H7 плюс N1 и H7 составила примерно 10%7% и 1% для клеточной линии A549 и 8%4% и 1% для MDCK, соответственно. Инфекционность вируса везикулярного стоматита G гликопротеина PP составила около 21% для A549 и 16% для клеток MDCK.
В то время как дельта конверт гликопротеинов PP показал никакой инфекционности. Важно помнить, что ПП производитель HEK-293T/17 клетки составляют основу этой процедуры. Таким образом, оптимальный рост научит нас HEK-293T/17 клеток является наиболее важным.
После этой процедуры или какого-либо другого теста, такого как L2, может быть выполнена ограниченная проверка. Этот анализ может почти избавиться от биологических особенностей рецепторов предпочтения и картина покажет тропизм PPS. Так как они взяли гликопротеины от вируса гриппа клонируются в два плюс максимум.
HA и NA белки могут быть изучены отдельно, поэтому мы reassortment между ними. Мутанты и зрелые эффекты могут быть изучены.
