인플루엔자 바이러스 PP를 생산하고 감염성을 결정하는이 기술은 BSL-2 도시에서 인플루엔자 바이러스의 연구를 단순화 할 수 있습니다. 우리는 PPS의 qRT-PCR 데이터를 기반으로 감염에 대한 조달청을 정상화했습니다. 2개의 당단백질 발현 플라스미드는 인코딩되어 바이러스 재구에 대한 연구를 단순화할 수 있습니다.
세포 씨를 뿌린 지 하루 후, 반전된 광 현미경으로 세포 형태와 밀도를 확인하십시오. 이상적으로 세포는 경질에서 대략 85% 응수되어야 합니다. 매체를 음편당 세럼이 없는 DMEM 1밀리리터로 교체하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
각 웰의 세포에 대해, 경질 시약의 8마이크로리터를 혈청 배지를 감소시 150 마이크로리터의 부피에 희석시. 용액을 부드럽게 섞고 실온에 5분간 앉게 하십시오. 한편, 2.5 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 158마이크로리터의 혈청 배지로 희석한다.
5 분 인큐베이션 후 희석 된 DNA를 희석 된 형질 검사 시약과 결합하고 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 둡니다. 혈청이 없는 배지의 세포와 함께 해당 우물에 DNA 지질 복합체를 추가합니다. 그런 다음 앞뒤로 흔들어 서 접시를 부드럽게 섞습니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4~6시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 매체를 제거하고 잘 당 DMEM의 두 밀리리터로 대체합니다. 그런 다음 36 ~48 시간 동안 다시 배양하십시오.
잘 당 10, 000 세포와 96 웰 플레이트에 취약 셀의 각 유형을 시드. 그런 다음 밤에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%로 둡니다. 형질 전환 후 셋째 날에는 분홍색 또는 약간 주황색으로 밝은 매체의 색상을 확인하고 440 ~ 460 나노미터 파장 아래 반전 된 플로레스센트 생물학적 현미경으로 세포를 검사하십시오.
트랜스펙트 후 38내지 48시간 후에, 0.45 마이크로미터 폴리비닐리덴 불소 막 필터를 통과하여 슈오타이핑 입자 또는 PPS를 수확하여 세포 이물질을 제거한 다음 소량의 알리코크로 나누어 섭씨 80도를 뺀 값으로 보관하십시오. 조달청을 정량화하기 위해 정제된 바이러스 입자30마이크로리터를 1.5 마이크로리터 RNase 프리 튜브로 옮기고 벤조나제 뉴클레아제 1마이크로리터를 첨가한다. DNA및 RNA 오염을 제거하기 위해 1시간 동안 37°C의 튜브를 배양합니다.
인큐베이션 후, 시료를 영하 70도까지 동결하여 핵을 활성화하고 단백질을 30분 동안 2마이크로리터의 단백질을 첨가하여 봉투 단백질을 소화하고 CMV-GFP RNA를 방출한다. 그런 다음 3 분 동안 섭씨 100도에서 단백질 Ae K를 비활성. 텍스트 원고에 지정된 프라이머 및 프로브에서 유니버설 프로브 원스텝 RT-qPCR 키트를 사용하여 정량적 역전사 RTPCR로 PPS를 정량화합니다.
MMLiter 당 4 회 10 ~ 5 번째 RNA 복사본으로 PPS를 정상화합니다. 그런 다음 H7N9 헤마글루티닌을 수용하는 PPS에 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도에 TPCK-트립신을 추가합니다. 기능하위유닛 HA1 및 HA2를 형성하기 위해 1시간 동안 PPS를 섭씨 37도에서 배양한다.
정규화된 PPS를 DMEM 배지와 1 대 1 비율로 혼합한 다음 취약한 세포를 포함하는 플레이트를 생물 안전 캐비닛에 가져옵니다. 수퍼네티드를 흡인하고 100 마이크로리터의 미리 데운 PBS로 세포를 한 번 씻으세요. 각 우물에 PPS-DMEM 혼합물 100 마이크로리터를 추가하여 각 PPS 유형의 감염성 테스트를 하나의 취약한 세포주로 세팅합니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 4~6시간, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 그런 다음 슈퍼나탄을 흡인하고 감염성 검출 전에 24~36시간 동안 플레이트를 배양하는 DCM 의 마이크로리터 100마이크로리터로 교체한다. 우리의 결과는 PPS는 지금 사람들에게 전염성이 있는 것으로 간주됩니다.
그래서 필요한 안전 가드 절차는 마스크를 착용하고 생물 안전 캐비닛에 감염성 검사를 수행하는 등의 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 2개의 그룹화된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 성혈구 스토마티스 바이러스 G 당단백질 또는 봉투 당단백질없음을 가진 10가지 유형의 의사형 입자 또는 PPS를 생성하기 위해 생성되었다. 조달청은 전염 전자 현미경으로 심화되었고 그들의 감염성은 두 개의 세포주, A549 및 MDCK에서 평가되었다.
H5를 수용하는 조달국 군에서는 H5N1, H5 플러스 N9 및 H5의 감염성은 세포주 A549 및 40%5%와 5%의 약 90%와 10%였다. H7을 수용하는 조달군에서는 H7N9, H7 플러스 N1 및 H7의 감염성은 셀주 A549 및 8%4%와 1%로 각각 약 10%7% 및 1%였다. 성구 구내염 바이러스 G 당단백질 PP의 감염성은 A549의 경우 약 21%, MDCK 세포의 경우 16%였다.
델타 봉투 당단백질 PP는 감염성을 나타내지 않았다. PP 생산업체 HEK-293T/17 세포가 이 절차의 기초에 해당한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 최적의 성장이 HEK-293T/17 세포를 가르치는 것이 가장 중요합니다.
이 절차 또는 L2와 같은 다른 테스트에 따라 경계 분석이 수행 될 수 있습니다. 이 분석체는 수용체 선호도의 생물학적 특수성을 거의 제거할 수 있으며 패턴은 PPS의 트로피주의를 드러낼 것이다. 그들은 인플루엔자 바이러스에서 당단백질을 했다 이후 두 플러스 최대로 복제.
HA와 NA 단백질은 별도로 연구할 수 있으므로 그(것)들 사이 를 재분류합니다. 돌연변이와 성숙한 효과를 탐구 할 수 있습니다.
