טכניקה זו של ייצור PP ויראלי שפעת וקביעת זיהומיות שלה יכול לפשט את המחקר של וירוס שפעת בעיר BSL-2. נרמלנו את PPS עבור זיהומים המבוססים על נתוני qRT-PCR של PPS. שני פלסמיד ביטוי גליקופרוטאין מקודדים, אשר יכול לפשט את המחקר על שיוך וירוס.
יום אחד לאחר זריעת התא, בדוק את מורפולוגיה התא וצפיפות תחת מיקרוסקופ אור הפוך. באופן אידיאלי התא צריך להיות כ 85%confluent ב transfection. החלף את המדיום עם מיליליטר אחד של DMEM ללא סרום לגם, והחזר את הצלחת לאנקובטור.
כדי שכל באר של תאים תחולף, לדלל שמונה microliters של reagent transfection לנפח של 150 microliters עם מדיום סרום מופחת. מערבבים את הפתרון בעדינות ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. בינתיים, לדלל 2.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך 158 microliters של מדיום סרום מופחת.
לאחר הדגירה של חמש דקות, מערבבים את הדנ"א המדולל עם רגנט טרנספיקציה מדולל, מערבבים בעדינות את הפתרון ומשאירים אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את קומפלקס השומנים DNA ל בארות המתאימות עם התאים במדיום ללא סרום. ואז מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי נדנדה קדימה ואחורה.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולהחליף אותו עם שני מיליליטר של DMEM לגם. ואז לה הדגירה אותו לעוד 36 עד 48 שעות.
זרע כל סוג של תא רגיש ב 10, 000 תאים ל הבאר וצלחת 96 גם. ואז להשאיר את הצלחת במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים חממת פחמן דו חמצני. ביום השלישי לאחר transfection, לבדוק את הצבע של המדיום אשר צריך להאיר ורוד או כתום מעט ולבחון את התאים עם מיקרוסקופ ביולוגי פלורסנט הפוך תחת 440 כדי 460 אורך גל ננומטר.
ב 38 עד 48 שעות לאחר transfection, לקצור את החלקיקים פסאודוטריד או PPS על ידי עובר אותם דרך 0.45 מיקרומטר פוליווינילידין פלואוריד מסנן פלואוריד כדי לחסל פסולת התא, ולאחר מכן לחלק אותם אליקים נפח קטן ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לכמת את PPS, להעביר 30 microliters של חלקיקים נגיפיים מטוהרים לצינור 1.5 microliter RNase חינם ולהוסיף מיקרוליטר אחד של נקלאז Benzonase. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לחסל כל זיהום DNA ו- RNA.
לאחר הדגירה, להקפיא את המדגם למינוס 70 מעלות צלזיוס כדי פעיל את הגרעין ולהוסיף שני microliters של Proteinase K.Incubate את התערובת במשך 30 דקות כדי לעכל את חלבוני המעטפה ולשחרר את CMV-GFP RNA. ואז לא פעיל פרוטאינאז K ב 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לכמת את PPS עם תמלול הפוך כמותי RTPCR באמצעות בדיקה אוניברסלית צעד אחד RT-qPCR קיט פריימרים ובדיקות שצוין בכתב היד טקסט.
לנרמל את PPS לארבע פעמים 10 עד עותקי RNA החמישי למיליליטר. לאחר מכן להוסיף TPCK-טריפסין לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לתוך PPS כי הנמלים H7N9 hemagglutinin. הדגירה PPS ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי ליצור את תת היחידות הפונקציונליות HA1 ו HA2.
מערבבים את PPS מנורמל עם מדיום DMEM ביחס אחד לאחד, ואז להביא את הצלחת המכילה תאים רגישים לארון biosafety. שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים פעם אחת עם 100 מיקרוליטרים של PBS מחומם מראש. הוסף 100 מיקרוליטרים של תערובת PPS-DMEM לתוך כל באר, שידל את בדיקות ההינקות של כל סוג של PPS לקו תא רגיש אחד.
דגירה הצלחת במשך ארבע עד שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן שאפו את העל-טבעי והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטרים של DCM, הדגירה את הצלחת למשך 24 עד 36 שעות נוספות לפני זיהוי הזיהום. התוצאות שלנו הן PPS נחשבים עכשיו זיהומיות לאנשים.
אז נהלי שמירה הכרחיים מומלץ לקחת כגון לבישת מסכה וביצוע בדיקות דביקות ב ארון biosafety. פרוטוקול זה יוצר כדי ליצור 10 סוגים של חלקיקים מדומה או PPS עם שני המגלוטין מקובצים ונוירמינידאז וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין או לא מעטפת גליקופרוטאינים. PPS דימוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ואת ההדביקות שלהם הוערכו בשני קווי תאים, A549 ו MDCK.
בקבוצת PPS המכילה H5, ההידביקות של H5N1, H5 plus N9 ו- H5 הייתה כ- 90%18% ו- 10% עבור קו התא A549 ו- 40%5% ו- 5% עבור MDCK, בהתאמה. בקבוצת PPS המכילה H7, ההידביקות של H7N9, H7 plus N1 ו- H7 הייתה כ- 10%7% ו- 1%עבור קו התא A549 ו- 8%4%ו- 1%עבור MDCK, בהתאמה. ההדלקה של וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין PP היה כ 21% עבור A549 ו 16% עבור תאי MDCK.
בעוד מעטפת הדלתא גליקופרוטאינים PP לא הראה שום להדביק. זה קריטי לזכור כי יצרנית PP HEK-293T/17 תאים מהווים את הבסיס של הליך זה. אז הצמיחה האופטימלית מלמדת אותנו שתאי HEK-293T/17 הם החשובים ביותר.
בעקבות הליך זה או בדיקה אחרת כגון L2 פתוח הבדיקה התוחמת ניתן לבצע. ההתדגם הזה כמעט יכול לפטור את המוזרויות הביולוגיות של העדפת הקולטן והתבנית תחשוף את הטרופוליזם של PPS. מאז שהם לקחו את הגליקופרוטאינים מנגיף שפעת משובטים לשניים פלוס מקסימום.
HA וחלבוני NA ניתן ללמוד בנפרד ולכן אנו reassortment ביניהם. ניתן לחקור את המוטנטים ואת ההשפעות הבוגרות.
