유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

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April 2nd, 2020

DOI :

10.3791/60808-v

April 2nd, 2020

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Hirofumi Nishizono*¹^,²^,³, Mohamed Darwish*⁴^,⁵, Hideki Uosaki⁶^,⁷, Nanami Masuyama⁸^,⁹^,¹⁰, Motoaki Seki⁸^,¹¹, Hiroyuki Abe³, Nozomu Yachie⁸^,⁹^,¹⁰^,¹²^,¹³, Ryohei Yasuda¹

¹Max Planck Florida Institute for Neuroscience, ²Life Science Research Center, University of Toyama, ³Department of Biochemical Engineering, Graduate School of Science and Engineering, Yamagata University, ⁴Graduate School of Innovative Life Science, University of Toyama, ⁵Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Cairo University, ⁶Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, ⁷Division of Stem Cell Research and Drug Development, Center for Development of Advanced Medical Technology, Jichi Medical University, ⁸Synthetic Biology Division, Research Center for Advanced Science and Technology, University of Tokyo, ⁹Institute for Advanced Biosciences, Keio University, ¹⁰Graduate School of Media and Governance, Keio University, ¹¹Department of Molecular Oncology, Graduate School of Medicine, Chiba University, ¹²Department of Biological Sciences, School of Science, University of Tokyo, ¹³College of Arts and Sciences, University of Tokyo

필기록

우리의 프로토콜은 단일 세포 마우스 배아에서 유전자 변형 마우스의 쉽고 효율적이며 신속하게 제조를 용이하게합니다. 우리의 프로토콜은 동결 해동 된 1 세포 단계 배아와 전기 기공의 사용을 결합하여 고효율 및 낮은 모자이크 속도로 돌연변이 마우스를 포함한 유전자 변형 마우스의 빠른 생성을 허용합니다. 체외 수정의 경우, 임신 한 암말 혈청 생식선 호르몬의 7.5 국제 단위의 인트라보네탈 주사를 통해 4 또는 8 주 된 여성 C57BL / 6J 마우스를 4 8 시간 후에 슈퍼 배란하여 시작하십시오.

다음으로, 성적으로 성숙한 3~5개월 된 남성 C57BL/6J 마우스에서 카우다 부피티미스를 제거하고 해부 바늘을 사용하여 정자의 혈전을 추출합니다. 그런 다음 HTF의 200 마이크로 리터 드롭에서 혈전을 섭씨 37도, 이산화탄소 는 5%로 1.5시간 동안 배양합니다. 인간의 융기 생식선 주입 후 16~18시간, 난소에서 적정 성 난낭 복합체를 수집하고 200개의 HTF 마이크로리터로 복합체를 배양하여 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 이하의 배양에 대한 큐베이션을 한다.

인큐베이션의 끝에서, 잠복기 배지의 경계에서 정액 현탁액의 1 내지 5 마이크로리터를 적혈구 난모세포 복합체의 200 마이크로리터 드롭에 추가하고 세포 배양 인큐베이터에 공동 배양을 3 시간 동안 배치한다. 인큐베이션의 끝에서, 칼륨보충 간단한 임의의 최적화 매체를 세 번 세척하여 남은 정자와 적수 세포를 제거하고 반전된 현미경을 사용하여 한 세포 배아의 프로핵 형성 및 등급을 확인한다. 1개의 세포 배아 냉동 보존을 위해, 세포 배양인에 있는 10 분 인큐베이션을 위해 20% 태아 소 혈청으로 보충된 HTF의 신선한 200 마이크로리터 드롭으로 배아를 전송합니다.

인큐베이션이 끝나면 20~100개의 배아를 1개의 어금니 디메틸 설옥산화물 용액의 50마이크로리터로 이송하고 용액 5마이크로리터에서 최대 100개의 배아를 극저온튜브 바닥으로 옮기다. 튜브 의 측면에 DAP213 용액의 45 마이크로 리터를 추가하기 전에 0섭씨에서 5 분 동안 배아를 식힙니다. 캡핑 후, 액체 질소에 튜브를 신속하게 저장하기 전에 0섭씨에서 추가로 5 분 동안 세포를 유지합니다.

CRISPR RNA의 마이크로리터 당 1 마이크로그램과 극치의 혈청 최소 필수 배지로 tracrRNA의 마이크로리터 당 1마이크로그램을 준비합니다. 각 RNA 용액의 6마이크로리터를 42마이크로리터의 뉴클레아제 프리 버퍼에 추가하고 혼합물을 섭씨 95도에서 3분간 건조 히터에 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 혼합물을 5분간 냉각하고 HiFi Cas9 단백질의 마이크로리터당 1마이크로그램을 최소한의 필수 배지로 준비합니다.

희석된 HiFi Cas9 용액6마이크로리터를 RNA 용액에 추가하고 최대 100개의 해동된 배아를 하나의 전체 유리 슬라이드에 생성된 리보뉴클레오단백질 복합용액의 25마이크로리터로 이송한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양합니다. 배아 전기포기의 경우, 배양의 끝에 전기포레이터 파라미터를 설정하고 슬라이드를 전기포레이터에 적재한다.

전기기는 게놈 편집이 DNA의 첫번째 복제의 앞에 생기고 모자이크를 방지하기 위하여 태아 해동의 1 시간 안에 능력을 발휘해야 합니다. 전기포기 후, 변형된 크렙스 링거 중탄산염 완충제 2매를 2개의 세척으로 3회 세척하여 칼륨 한 방울을 함유하고 액체 파라핀으로 덮인 심플렉스 최적화 배지를 보충한다. 그런 다음 신선한 칼륨으로 배아를 배양하여 하룻밤 동안 세포 배양 배양에서 심플렉스 최적화 배지를 보충하였다.

1세포 배아를 위한 이 수정된 냉동 보존 방법을 사용하면 동결 해동된 배아의 발달 속도를 2세포 단계로 향상시킨다. 이 방법을 사용하여, 본 대표적인 실험에서 생성된 마우스의 모든 것은 백색과 검은색 패치로 코트를 베어링한 모자이크 마우스가 하나만 있는 알비노였다. 여기서 M1 대립구를 포함하는 알비노 마우스로부터 크로마토그램의 대표적인 부분을 관찰할 수 있다.

그림과 같이, 프로토콜은 높은 효율과 낮은 모자이크 비율로 녹아웃 및 노크 마우스를 생성할 수 있습니다. 실제로, 호머지구스 F0 자손의 F1 자손은 이질적인 돌연변이가 없는 1개의 돌연변이및 1개의 야생모형 대립유전자를 포함하는 이종화구입니다. 수정란이 한 세포 단계에서 깨지기 쉽다는 것을 기억하십시오.

태아 소 혈청의 첨가는 배아를 강화합니다. 그러나 각 단계에서 신중하게 처리해야 합니다. 이 방법은 유전자 변형 마우스의 빠르고 효율적인 생산을 촉진하여 인간 질환에서 유전자 기능 및 연구의 분석에 기여할 수 있습니다.

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