Наш протокол облегчает подготовку генетически модифицированных мышей легко, эффективно и быстро из одноклеточных эмбрионов мыши. Наш протокол сочетает в себе использование лиофилоотных одноклеточных эмбрионов и электропорации, что позволяет быстрому поколению генетически модифицированных мышей, включая мышей-мутантов, с высокой эффективностью и низкой скоростью мозаики. Для экстракорпорального оплодотворения, начните с супер овуляции четырех или восьминедельной самки мышей C57BL/6J через внутриперитонеалевую инъекцию 7,5 международных единиц гонадотропина сыворотки беременной кобылы, а затем интраперитонеальной инъекции 7,5 международных единиц человеческого хорионического гонадотропина 48 часов спустя.
Далее, удалить cauda epididymis от сексуально зрелых трех до пятимесячного мужчины C57BL/6J мышей и использовать вскрытия иглы для извлечения тромбов сперматозоидов. Затем инкубировать сгустки в 200 микролитер падение HTF при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 1,5 часов для емкости. Через 16-18 часов после инъекции хорионического гонадотропина человека соберите комплексы ооцитов кумуляции из яйцеклетки и инкубировать комплексы 200 микролитров HTF, покрытых жидким парафином для не более чем двухчасовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры.
В конце инкубации добавьте от одного до пяти микролитров суспензии спермы от границы инкубационо-инкубационой среды до 200 микролитровых капель кумулятивных ооцитных комплексов и поместите со-культуру в инкубатор клеточной культуры в течение трех часов. В конце инкубации, мыть яйцеклетки с калием дополнены систока оптимизации среды три раза, чтобы удалить оставшиеся сперматозоиды и кучевые клетки и использовать перевернутый микроскоп, чтобы проверить пронуклеарное образование и класс одноклеточных эмбрионов. Для криоконсервации одного клеточного эмбриона, переносить эмбрионы в свежую 200 микролитровую каплю HTF, дополненную 20%фетальной сывороткой крупного рогатого скота для 10-минутной инкубации в инкубаторе клеточной культуры.
В конце инкубации перенесите от 20 до 100 эмбрионов на 50 микролитров одного молярного диметилфсидного раствора и перенесите до 100 эмбрионов в пять микролитров раствора на дно криотрубы. Охладите эмбрионы в течение пяти минут при нулевом градусе Цельсия, прежде чем добавить 45 микролитров раствора DAP213 вниз по стороне трубки. После укупорки, держать клетки в течение дополнительных пяти минут при нулевом градусе по Цельсию, прежде чем быстро хранить трубку в жидком азоте.
Приготовьте один микрограмм на микролитр РНК CRISPR и один микрограмм на микролитр тракр РНК в уменьшенной сыворотке минимальной необходимой среды. Добавьте шесть микролитров каждого раствора РНК в 42 микролитера буфера без нуклеазы и поместите смесь в сухой обогреватель в течение трех минут при 95 градусах Цельсия. В конце инкубации охладите смесь при комнатной температуре в течение пяти минут и приготовьте один микрограмм на микролитер белка HiFi Cas9 с уменьшенной сывороткой минимальной необходимой среды.
Добавьте шесть микролитров разбавленного раствора HiFi Cas9 в раствор РНК и перенесите до 100 размороженых эмбрионов в 25 микролитров полученного раствора рибонуклеопротеина в одну целую стеклянную горку. Затем инкубировать эмбрионы в течение 10 минут при 37 градусах по Цельсию. Для электропорации эмбриона в конце инкубации установите параметры электропоратора и загрузите слайд на электропоратор.
Электропорация должна быть выполнена в течение одного часа после оттаивания эмбриона, чтобы гарантировать, что редактирование генома происходит до первой репликации ДНК и для предотвращения мозаичности. После электропорации, мыть эмбрионы три раза с модифицированным Кребс-Рингер бикарбонат буфера две среды в двух моет с каплей калия дополнены сикс оптимизации среды покрыты жидким парафином. Затем инкубировать эмбрионы в свежем калии дополнили сикс оптимизации среды в инкубаторе клеточной культуры на ночь.
Использование этого модифицированного метода криоконсервации для одноклеточных эмбрионов улучшает скорость развития замерзаемых эмбрионов до двухклеточной стадии. Используя этот метод, все порожденные мыши в этом репрезентативном эксперименте были альбиносом только с одной мозаичной мышью с пальто с белыми и черными пятнами. Здесь можно наблюдать репрезентативную секцию хроматограммы мыши-альбиноса, содержащую аллель M1.
Как показано на примере, протокол может генерировать нокаут и стук в мышей с высокой эффективностью и низкой скоростью мозаики. Действительно, F1 потомство гомозиготных потомков F0 являются гетерозиготными, содержащими одного мутанта и один дикий тип аллеля без разрозненных мутаций. Помните, что оплодотворенная яйцеклетка хрупкая на одноклеточной стадии.
Добавление сыворотки крупного рогатого скота плода усиливает эмбрион. Тем не менее, она должна быть обработана тщательно на каждом шагу. Этот метод может способствовать анализу функции генов и исследованиям заболеваний человека, способствуя более быстрому и эффективному производству генетически модифицированных мышей.
