Protokolümüz, tek hücreli fare embriyolarından genetiği değiştirilmiş farelerin kolayca, verimli ve hızlı bir şekilde hazırlanmasını kolaylaştırıyor. Protokolümüz, dondurulan tek hücreli evre embriyoların kullanımını ve elektroporasyonun, mutant fareler de dahil olmak üzere, yüksek verimlilik temalı ve düşük mozaik hızlarda genetiği değiştirilmiş farelerin hızlı bir şekilde neslinin oluşmasına olanak sağlıyor. In vitro fertilizasyon için, 48 saat sonra 7.5 uluslararası hamile mare serum gonadotropin intraperitoneal üniteler intraperitoneal enjeksiyon yoluyla dört veya sekiz haftalık dişi C57BL/6J farelerin süper yumurtlama ile başlar.
Daha sonra, cinsel olgun üç ila beş aylık erkek C57BL/6J fareler den kauda epididim kaldırmak ve spermatozoa pıhtıları ayıklamak için bir diseksiyon iğnesi kullanın. Daha sonra pıhtıları 37 santigrat derecede 200 mikrolitrelik htf damlasında ve kapaizat için 1,5 saat boyunca %5 karbondioksit le kuluçkaya yatırın. 16 ila 18 saat insan koryonik gonadotropin enjeksiyonu sonra, oviducts kümülüs yumurta kompleksleri toplamak ve htf 200 mikrolitre sıvı parafin ile kaplı ile kompleksleri kuluçka hücre kültürü kuluçka en fazla iki saat kuluçka için.
Kuluçka sonunda, kümülüs yumurta komplekslerinin 200 mikrolitrelik damlasına kuluçka ortamının sınırından bir ila beş mikrolitre sperm süspansiyonu ekleyin ve eş kültürü hücre kültürü kuluçka makinesine üç saat yerleştirin. Kuluçka sonunda, kalan sperm ve kümülüs hücrelerini çıkarmak için üç kez potasyum takviyeli simpleks optimizasyon ukalayumurtaları yıkayın ve bir hücre embriyolarının pronükleer oluşumunu ve derecesini kontrol etmek için ters bir mikroskop kullanın. Bir hücreli embriyo kriyoprezervasyon için, hücre kültürü kuluçka 10 dakikalık kuluçka için% 20 fetal sığır serumu ile takviye HTF taze bir 200 mikrolitre damla içine embriyolar transfer.
Kuluçka sonunda, 20 ila 100 embriyoyu bir molar dimetil sülfoksit çözeltisinin 50 mikrolitresine aktarın ve beş mikrolitre çözeltide 100 embriyoyu bir kriyotubeun dibine aktarın. Tüpün yan tarafına 45 mikrolitre DAP213 çözeltisi eklemeden önce embriyoları sıfır derecede beş dakika soğutun. Kapama sonra, hızlı bir şekilde sıvı azot tüp depolamadan önce sıfır santigrat derecede ek bir beş dakika hücreleri tutun.
CRISPR RNA mikrolitre başına bir mikrogram ve azaltılmış serum minimal esansiyel ortamda tracrRNA mikrolitre başına bir mikrogram hazırlayın. 42 mikrolitre nükleaz içermeyen tampona her RNA çözeltisinin altı mikrolitresini ekleyin ve karışımı 95 santigrat derecede üç dakika kuru bir ısıtıcıya yerleştirin. Kuluçka sonunda, karışımı oda sıcaklığında beş dakika soğutun ve azaltılmış serum minimal esansiyel orta ile HiFi Cas9 proteininin mikrolitrebaşına bir mikrogramHazırlayın.
RNA çözeltisine seyreltilmiş HiFi Cas9 çözeltisinin altı mikrolitresini ekleyin ve 100'e kadar çözülmüş embriyoyu, elde edilen ribonükleoprotein kompleks çözeltisinin 25 mikrolitresine tek bir cam slaytta aktarın. Sonra embriyoları 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Embriyo elektroporasyonu için, kuluçka sonunda, elektroporatör parametrelerini ayarlayın ve slaytı elektroporatöre yükleyin.
Genom düzenlemesinin DNA'nın ilk replikasyonundan önce gerçekleşmesini sağlamak ve mozaiği önlemek için embriyo nun erimesinden sonraki bir saat içinde elektroporasyon yapılmalıdır. Elektroporasyondan sonra, embriyoları modifiye Krebs-Ringer bikarbonat tamponu ile iki yıkamada iki orta ile üç kez yıkayın ve sıvı parafin le kaplı bir damla potasyum takviyeli simpleks optimizasyon uması ile. Sonra taze potasyum destekli simpleks optimizasyonu aracı hücre kültürü kuluçka bir gecede embriyolar kuluçka.
Tek hücreli embriyolar için bu değiştirilmiş kriyopreservation yöntemini kullanarak iki hücreli aşamaya dondurulan çözülmüş embriyoların gelişim hızını artırır. Bu yöntemi kullanarak, bu temsili deneyde oluşturulan farelerin hepsi beyaz ve siyah yamalar ile bir ceket taşıyan sadece bir mozaik fare ile albino edildi. Burada M1 aleleiçeren bir albino fareden bir kromatogramın temsili bir bölümü gözlemlenebilir.
Gösterildiği gibi, protokol nakavt ve knock-in fareler yüksek verimlilik ve düşük mozaik oranları ile üretebilir. Gerçekten de homozigot F0 yavrularının F1 yavruları bir mutant ve birbirinden farklı mutasyonlar olmayan bir yabani tip alel içeren heterozigotdur. Döllenmiş yumurtanın tek hücreli aşamada kırılgan olduğunu unutmayın.
Fetal sığır serumunun eklenmesi embriyoyu güçlendirir. Ancak, her adımda dikkatle ele alınmalıdır. Bu yöntem, genetiği değiştirilmiş farelerin daha hızlı ve verimli bir şekilde üretilmesine katkıda bulunarak insan hastalıklarında gen fonksiyonunun ve araştırmalarının analizine katkıda bulunabilir.
