使用冷冻胚胎进行转基因小鼠高效生产

我们的协议有助于从单细胞小鼠胚胎轻松、高效和快速地制备转基因小鼠。我们的协议结合了冷冻解冻单细胞阶段胚胎和电穿孔的使用，允许快速生成转基因小鼠，包括高效和低马赛克率的突变小鼠。对于体外受精，首先通过7.5国际单位的怀孕母马血清腺腺激素的内向性注射，开始超级排卵4周或8周大的雌性C57BL/6J小鼠，48小时后再进行7.5国际单位的人类胆管性腺量腺激素注射。

接下来，从性成熟三到五个月大的雄性C57BL/6J小鼠身上取出卡乌达表皮，并使用解剖针提取精子的血块。然后在37摄氏度下孵育200微升HTF和5%二氧化碳的血块，1.5小时进行封顶。人类胆碱性腺激素注射后16至18小时，从细胞收集积液卵母细胞复合物，用200微升HTF覆盖的HTF细胞孵化，在细胞培养箱中孵化不超过两个小时。

在孵化结束时，将一至五微升精子悬浮液从孵化媒介的边界添加到200微升的积卵细胞复合物滴中，并将联合培养物放在细胞培养孵化器中三小时。在孵化结束时，用钾补充的简单细胞优化介质三次清洗卵母细胞，去除任何剩余的精子和积液细胞，并使用倒置显微镜检查单细胞胚胎的亲核形成和等级。对于一个细胞胚胎冷冻保存，将胚胎移植到新鲜200微升的HTF滴中，辅以20%的胎儿牛血清，在细胞培养箱中孵化10分钟。

在孵育结束时，将20至100个胚胎转移到50微升的一个摩尔二甲基硫化物溶液中，并在5微升溶液中移植至冷冻管底部的100个胚胎。在零摄氏度下冷却胚胎5分钟，然后将45微升DAP213溶液加入管侧。封盖后，在零摄氏度下将细胞再保留五分钟，然后快速将管子储存在液氮中。

在减少的血清最小基本介质中，每微升CRISPRRNA准备1微克，每微升1微克。在每个RNA溶液中加入6微升，加入42微升无核酸酶缓冲液，并在95摄氏度下将混合物放入干燥加热器中3分钟。在孵化结束时，在室温下冷却混合物五分钟，用减少的血清最小基本介质，每微升高一微克高一微克的HiFi Cas9蛋白。

将稀释的HiFi Cas9溶液的6微升加入RNA溶液中，并在一个整张玻璃幻灯片中将多达100个解冻胚胎转移到由此产生的核糖核蛋白复合溶液的25微升中。然后在37摄氏度下孵育胚胎10分钟。对于胚胎电穿孔，在孵育结束时，设置电穿孔器参数，然后将幻灯片加载到电穿孔器上。

电穿孔应在胚胎解冻后一小时内进行，以确保在第一次复制DNA之前进行基因组编辑，并防止马赛克。电穿孔后，用经过改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液两种介质洗三次，用一滴钾补充的单纯的优化介质，用液体石蜡覆盖。然后在细胞培养培养箱中孵育新鲜钾补充简单优化培养的胚胎。

对单细胞胚胎采用这种经过改良的冷冻保存方法，可提高冷冻冷冻胚胎发育速度至双细胞阶段。使用这种方法，在这个代表性实验中生成的所有小鼠都是白化病，只有一只马赛克小鼠携带白色和黑色斑块的外衣。在这里，可以观察到含有M1等位基因的白化病小鼠的色谱图的代表性部分。

如图所示，该协议可以产生敲击和敲击鼠标与高效率和低镶嵌率。事实上，同源F0后代的F1后代是异质体，含有一个突变体和一种野生型等位基因，没有不同的突变。请记住，受精卵在单细胞阶段是脆弱的。

胎儿牛血清的加入可强化胚胎。但是，必须在每个步骤中小心处理。这种方法有助于基因功能分析和人类疾病研究，促进转基因小鼠更快、更高效地生产。