Questo protocollo può essere utilizzato per misurare il numero di siti antigenici sul recettore cellulare di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che produce risultati robusti, anche per i recettori espressi a bassa densità. Questo metodo consente la valutazione della riduzione dell'espressione degli etitrociti CR1 e questo è come Alzheimer, lupus eritematoso sistemico, AIDS e malaria.
Questo protocollo è utile per qualsiasi analisi della densità del recettore cellulare e può anche essere applicato allo studio dell'espressione del recettore cellulare tramite microscopio a fluorescenza. Si consiglia di spaziare i tubi durante la distribuzione cellulare e anticorpale e di essere accompagnati da uno specialista citometrico durante la prima analisi, se possibile. La dimostrazione visiva dell'immunostaining e della quantificazione della densità per citometria del flusso è fondamentale per capire come impostare correttamente i parametri di analisi.
Prima di iniziare l'analisi, aggiungere 250 microlitri di sangue intero anticoagulato DI SODIO EDTA da tubi di stoccaggio del sangue in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di quattro gradi Celsius PBS-BSA. Mescolare il contenuto del tubo per inversione delicata e far girare le cellule per centrifugazione. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per scartare il supernatante e rimescolare con cura il pellet nel volume residuo della soluzione.
Aggiungere 20 millilitri di PBS-BSA freddo e centrifugare nuovamente le cellule. Al termine della centrifugazione, posizionare il tubo in un rack, posto sul ghiaccio e trasferire otto microlitri degli eriociti lavati in un tubo da 50 millilitri contenente tre millilitri di PBS-BSA. Quindi mescolare delicatamente gli eriociti girando per ottenere una sospensione cellulare omogenea.
Per l'immunosottenimento degli etitrociti, trasferire con cura 100 microlitri degli eriociti diluiti in singoli tubi da 1,5 millilitri e raccogliere i globuli rossi mediante centrifugazione. Dopo aver scartato i supernaganti, aggiungere con cura 20 microlitri di una concentrazione di 0,5 microgrammi per microlitri di anticorpo biotinilato anti-CR1 J3D3 in PBS-BSA, direttamente ad ogni pellet. Aggiungere 20 microlitri di tampone PBS-BSA alle sole celle di controllo negative con miscelazione delicata e incubare i campioni per 45 minuti a quattro gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, lavare i campioni due volte con 750 microlitri di PBS-BSA fresco per tubo, per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere 20 microlitri di una o 10 diluizione di fichererina streptavidina in PBS-BSA a ciascun tubo con miscelazione delicata e incubare i campioni per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare i campioni due volte, come dimostrato.
Dopo il secondo lavaggio, fissare ogni pellet di campione di cella con 450 microlitri di tampone di fissaggio durante il vortice, prima di trasferire ogni campione in singoli tubi inferiori rotondi da cinque millilitri per un massimo di 48 ore di conservazione a quattro gradi Celsius. Per analizzare gli eriociti immunososteniati per la citometria del flusso, fare clic sul nuovo pulsante dell'esperimento nel citometro di flusso e rinominare il nuovo esperimento. Selezionate dispersione in avanti, dispersione laterale e PE nella finestra delle impostazioni del citometro.
Nell'esperimento aperto, selezionare le impostazioni dell'applicazione delle impostazioni del citometro e creare un foglio di lavoro globale, utilizzando le scatole grigie e i capelli incrociati per guidare l'ottimizzazione. Una volta impostati tutti i parametri, caricare il tubo di controllo non macchiato sul citometro ed eseguire l'acquisizione, ottimizzando le tensioni di dispersione avanti e laterale per eliminare i detriti e garantire che la popolazione di interesse sia su larga scala. Successivamente, disegna un cancello intorno ai globuli rossi sulla trama di dispersione anteriore contro laterale e mostra la popolazione di globuli rossi nella trama puntino della fluorescenza pe.
Se le popolazioni positive sono in scala, caricare il tubo di controllo macchiato sul citometro ed eseguire l'acquisizione. Per registrare e analizzare campioni, scaricare il campione colorato e creare un grafico a dispersione avanti o laterale e un istogramma a fluorescenza PE in un nuovo foglio di lavoro globale. Caricare il primo campione sul citometro, eseguire l'acquisizione e disegnare un cancello rosso dei globuli attorno agli eriociti nella trama di dispersione anteriore o laterale.
Visualizzare la popolazione di globuli rossi nell'istogramma a fluorescenza PE e nella scheda statistiche selezionare la media per i parametri di fluorescenza pe sulle popolazioni di globuli rossi. Nel dashboard di acquisizione selezionare tutti gli eventi nel gate di arresto e 10.000 eventi da registrare e fare clic su registra dati. Al termine della registrazione dell'evento, rimuovere il tubo dal citometro.
I grafici globali del foglio di lavoro devono essere come illustrato. L'analisi citometrica del flusso degli eriociti immunososteniati provenienti da tre soggetti di densità CR1 note consente di misurare l'intensità media di fluorescenza dell'etichettatura per ciascun soggetto. Tracciare una curva utilizzando i valori del soggetto con la densità nota dell'eriocite CR1 consente di riportarli in funzione dell'intensità media della fluorescenza.
Il confronto della linea di regressione risultante da questa curva con i valori dell'intensità media di fluorescenza degli altri soggetti consente di determinare la loro densità di eriociti CR1. Fare attenzione che gli eriociti e gli anticorpi siano distribuiti correttamente, quindi le curve di calibrazione dei campioni sperimentati sul controllo negativo rientrano nell'intervallo delle impostazioni del citometro. È possibile adattare questa procedura per misurare altri recettori cellulari di densità, semplicemente cambiando l'anticorpo primario e /o adattando gli strati di amplificazione.
Ogni volta che si maneggia il sangue, c'è il rischio di contaminazione da agenti patogeni. Pertanto, assicurarsi di utilizzare buone pratiche di laboratorio e di indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati.
