유세포 분석을 사용하여 적혈구 보체 1 보체 측정

이 프로토콜은 관심의 세포 수용체에 항원 부위의 수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저밀도로 발현된 수용체에 대해서도 견고한 결과를 생성한다는 것입니다. 이 방법은 CR1 적혈구 발현의 감소의 평가를 가능하게 하고 이것은 알츠하이머병, 전신 루푸스 홍반, 에이즈 및 말라리아와 같은 것입니다.

이 프로토콜은 세포 수용체 밀도의 모든 분석에 유용하며 형광 현미경에 의한 세포 수용체 발현 연구에도 적용될 수 있다. 우리는 세포 와 항체 분포 동안 튜브를 간격을 두는 것이 좋습니다, 가능한 경우 첫 번째 분석 중에 세포 전문가와 동반. 유동 세포측정에 의한 면역염색 및 밀도 정량화의 시각적 데모는 분석 파라미터를 올바르게 설정하는 방법을 이해하는 데 매우 중요합니다.

분석을 시작하기 전에, 4섭씨 PBS-BSA의 20 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원옥 관에 혈액 저장 관에서 EDTA 항응성 전혈의 250 마이크로리터를 추가합니다. 튜브 내용기를 부드러운 반전으로 섞고 세포를 원심분리로 회전시합니다. 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 상체를 폐기하고 잔류 용액 의 펠릿을 조심스럽게 재보힙합니다.

감기 PBS-BSA의 20 밀리리터를 추가하고 세포를 원심분리합니다. 원심 분리의 끝에, 랙에 튜브를 배치, 얼음에 배치하고 PBS-BSA의 세 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 튜브로 세척 적혈구의 8 마이크로 리터를 전송. 그런 다음 균일 한 세포 현탁액을 얻기 위해 회전하여 적혈구를 부드럽게 혼합합니다.

적혈구 면역 염색의 경우 희석 된 적혈구 의 100 마이크로 리터를 개별 1.5 밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮기고 원심 분리에 의해 적혈구를 수집합니다. 수퍼나티를 폐기한 후, PBS-BSA에 바이오티니화 항 CR1 J3D3 항체의 마이크로리터 농도당 0.5 마이크로그램의 20마이크로리터를 각 펠릿에 직접 첨가한다. PBS-BSA 버퍼 20마이크로리터를 음의 대조체 세포에 단독으로 추가하고 4°C에서 45분 동안 시료를 배양합니다.

인큐베이션이 끝나면 세척당 튜브 당 750 마이크로리터의 신선한 PBS-BSA로 샘플을 두 번 세척하십시오. 두 번째 세척 후 PBS-BSA에 1~10개의 스트렙타비딘 피코에리스린을 희석한 20마이크로리터를 완만한 믹싱으로 각 튜브에 추가하고 4°C에서 45분 동안 샘플을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 시연된 대로 샘플을 두 번 세척합니다.

두 번째 세척 후, 각 셀 샘플 펠릿을 450 마이크로리터의 고정 버퍼로 고정한 후 각 샘플을 4°C까지 최대 48시간 동안 개별 5밀리리터 라운드 바닥 튜브로 전송합니다. 유동 세포측정을 위한 면역염색된 적혈구를 분석하려면, 유동 세포계의 새 실험 버튼을 클릭하고 새로운 실험의 이름을 바꿉니다. 사이토미터 설정 창에서 전방 분산, 측면 산란 및 PE를 선택합니다.

열린 실험에서 사이토미터 설정 응용 프로그램 설정을 선택하고 회색 상자와 십자선을 사용하여 최적화를 안내하는 전역 워크시트를 만듭니다. 모든 파라미터가 설정된 경우, 스테인드되지 않은 제어 튜브를 사이토미터에 로드하고 인수를 실행하여 전방 및 측면 산란 전압을 최적화하여 이물질을 제거하고 관심 모집단이 규모에 있는지 확인합니다. 다음으로, 전방에 적혈구 주위의 게이트를 그리고 측면 산란 플롯을 표시하고 PE 형광의 점 플롯에 적혈구 집단을 표시한다.

양수 집단이 규모에 있는 경우 스테인드 컨트롤 튜브를 사이토미터에 적재하고 인수를 실행합니다. 샘플을 기록하고 분석하려면 스테인드 샘플을 언로드하고 새로운 글로벌 워크시트에서 전방 대 측면 분산 플롯 및 PE 형광 히스토그램을 만듭니다. 첫 번째 샘플을 사이토미터에 로드하고, 인수를 실행하고 전방과 측면 산란 플롯의 적혈구 주위에 적혈구 게이트를 그립니다.

PE 형광 히스토그램및 통계 탭하에서 적혈구 집단을 표시하고, 적혈구 집단에 대한 PE 형광 파라미터에 대한 평균을 선택한다. 수집 대시보드에서 정지 게이트및 10, 000 이벤트를 모두 선택하고 레코드 데이터를 클릭합니다. 이벤트 기록이 완료되면 세포계에서 튜브를 제거합니다.

전역 워크시트 플롯은 그림처럼 보여야 합니다. 알려진 CR1 밀도의 세 가지 피험자로부터 면역 염색 된 적혈구의 흐름 세포 측정 분석은 각 주제에 대한 라벨링의 평균 형광 강도를 측정 할 수 있습니다. 적혈구 CR1의 알려진 밀도로 피사체의 값을 사용하여 곡선을 플로팅하면 이러한 데이터를 평균 형광 강도의 함수로 보고할 수 있습니다.

이 곡선에서 다른 피험자의 평균 형광 강도의 값으로 인한 회귀 선을 비교하면 CR1 적혈구 밀도를 결정할 수 있습니다. 적혈구와 항체가 제대로 분포되어 있으므로 음의 대조군에서 실험된 시료의 교정 곡선은 사이토미터 설정범위 내에 있습니다. 이 절차를 조정하여 다른 밀도 세포 수용체를 측정할 수 있으며, 단순히 1차 항체를 변경하고 증폭 층을 적응시키는 것만으로도 가능합니다.

혈액을 취급할 때마다 병원균 오염의 위험이 있습니다. 따라서, 좋은 실험실 관행을 사용하고 적절한 개인 보호 장비를 착용해야합니다.