Ce protocole peut être utilisé pour mesurer le nombre de sites antigéniques sur les récepteurs cellulaires d’intérêt. Le principal avantage de cette technique est qu’elle produit des résultats robustes, même pour les récepteurs exprimés à faible densité. Cette méthode permet l’évaluation de la réduction de l’expression des érythrocytes CR1 et c’est comme la maladie d’Alzheimer, lupus systémique érythémateux, le sida et le paludisme.
Ce protocole est utile pour toute analyse de la densité des récepteurs cellulaires et peut également être appliqué à l’étude de l’expression des récepteurs cellulaires au microscope à fluorescence. Nous recommandons d’espacer les tubes pendant la distribution des cellules et des anticorps, et d’être accompagnés d’un spécialiste cytométrique lors de la première analyse si possible. La démonstration visuelle de la quantification de l’immunostaining et de la densité par cytométrie de flux est essentielle pour comprendre comment bien définir les paramètres d’analyse.
Avant de commencer l’analyse, ajoutez 250 microlitres de sang entier anticoagulé EDTA de sodium provenant de tubes de stockage sanguin dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS-BSA de quatre degrés Celsius. Mélanger le contenu du tube par inversion douce et faire tourner les cellules par centrifugation. Utilisez une pipette de 10 millilitres pour jeter le supernatant et resuspendez soigneusement la pastille dans le volume résiduel de solution.
Ajouter 20 millilitres de PBS-BSA froid et centrifuger à nouveau les cellules. À la fin de la centrifugation, placer le tube dans une grille, placé sur la glace et transférer huit microlitres des érythrocytes lavés dans un tube de 50 millilitres contenant trois millilitres de PBS-BSA. Mélangez ensuite doucement les érythrocytes en filature pour obtenir une suspension cellulaire homogène.
Pour l’immunostaining d’érythrocyte, transférez soigneusement 100 microlitres des érythrocytes dilués dans les tubes individuels de 1,5 millilitre et recueillez les globules rouges par centrifugation. Après avoir jeté les supernatants, ajouter soigneusement 20 microlitres d’une concentration de 0,5 microgramme par microlitre d’anticorps anti-CR1 J3D3 biotinylated dans PBS-BSA, directement à chaque granule. Ajouter 20 microlitres de tampon PBS-BSA seul aux cellules de contrôle négatives avec mélange doux et incuber les échantillons pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, laver les échantillons deux fois avec 750 microlitres de PBS-BSA frais par tube, par lavage. Après le deuxième lavage, ajouter 20 microlitres d’une à 10 dilution de la phycoerythrine streptavidine dans PBS-BSA à chaque tube avec un mélange doux, et incuber les échantillons pendant 45 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les échantillons deux fois, comme démontré.
Après le deuxième lavage, fixer chaque granulé d’échantillon cellulaire avec 450 microlitres de tampon de fixation pendant le vortex, avant de transférer chaque échantillon dans des tubes de fond ronds de cinq millilitres individuels pour un total de 48 heures de stockage à quatre degrés Celsius. Pour analyser les érythrocytes immunotachés pour la cytométrie du débit, cliquez sur le nouveau bouton d’expérience dans le cytomètre d’écoulement et renommez la nouvelle expérience. Sélectionnez scatter avant, side scatter et PE dans la fenêtre paramètres du cytomètre.
Dans l’expérience ouverte, sélectionnez les paramètres d’application des paramètres du cytomètre et créez une feuille de travail globale, en utilisant les boîtes grises et les poils croisés pour guider l’optimisation. Lorsque tous les paramètres ont été définis, chargez le tube de commande non taché sur le cytomètre et exécutez l’acquisition, optimisant les tensions de dispersion avant et latérale pour éliminer les débris et s’assurer que la population d’intérêt est à l’échelle. Ensuite, dessinez une porte autour des globules rouges sur la parcelle de dispersion avant contre côté et affichez la population de globules rouges dans la parcelle de points de la fluorescence pe.
Si les populations positives sont sur l’échelle, chargez le tube de commande taché sur le cytomètre et exécutez l’acquisition. Pour enregistrer et analyser des échantillons, déchargez l’échantillon taché et créez une parcelle de dispersion avant contre côté et un histogramme de fluorescence PE sur une nouvelle feuille de travail globale. Chargez le premier échantillon sur le cytomètre, exécutez l’acquisition et dessinez une porte de globule rouge autour des érythrocytes dans la parcelle de dispersion avant contre côté.
Affichez la population de globules rouges dans l’histogramme de fluorescence pe et sous l’onglet statistiques, sélectionnez la moyenne pour les paramètres de fluorescence PE sur les populations de globules rouges. Dans le tableau de bord d’acquisition, sélectionnez tous les événements de la porte d’arrêt et 10 000 événements à enregistrer et cliquez sur les données d’enregistrement. Lorsque l’enregistrement de l’événement est terminé, retirez le tube du cytomètre.
Les parcelles de feuilles de travail globales devraient être illustrées. L’analyse cytométrique de flux des érythrocytes immunotachés de trois sujets de densités connues de CR1 permet de mesurer l’intensité moyenne de fluorescence de l’étiquetage pour chaque sujet. Tracer une courbe en utilisant les valeurs du sujet avec la densité connue de l’érythrocyte CR1 permet de rapporter ces données en fonction de l’intensité moyenne de fluorescence.
La comparaison de la ligne de régression résultant de cette courbe aux valeurs de l’intensité moyenne de fluorescence des autres sujets permet de déterminer leur densité d’érythrocytes CR1. Faites en sorte que les érythrocytes et les anticorps soient correctement distribués, de sorte que les courbes d’étalonnage des échantillons expérimentés sur le contrôle négatif se trouvent dans la gamme des paramètres du cytomètre. Il est possible d’adapter cette procédure pour mesurer d’autres récepteurs cellulaires de densité, simplement en changeant l’anticorps primaire et/ou en adaptant les couches d’amplification.
Chaque fois que vous manipulez du sang, il y a un risque de contamination par des agents pathogènes. Par conséquent, assurez-vous d’utiliser de bonnes pratiques de laboratoire et de porter l’équipement de protection individuelle approprié.
