Este protocolo se puede utilizar para medir el número de sitios antigénicos en el receptor celular de interés. La principal ventaja de esta técnica es que produce resultados robustos, incluso para receptores expresados a baja densidad. Este método permite evaluar la reducción de la expresión de eritrocitos CR1 y esto es como la enfermedad de Alzheimer, lupus eritematoso sistémico, SIDA y malaria.
Este protocolo es útil para cualquier análisis de la densidad del receptor celular y también se puede aplicar al estudio de la expresión del receptor celular por microscopio de fluorescencia. Recomendamos espaciar los tubos durante la distribución celular y de anticuerpos, y estar acompañados por un especialista citométrico durante el primer análisis si es posible. La demostración visual de la inmunosuferiente y la cuantificación de la densidad por citometría de flujo es fundamental para comprender cómo establecer correctamente los parámetros de análisis.
Antes de comenzar el análisis, agregue 250 microlitros de sangre entera anticoagulada EDTA de sodio de tubos de almacenamiento de sangre en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de cuatro grados Celsius PBS-BSA. Mezclar el contenido del tubo mediante una inversión suave y girar las células por centrifugación. Utilice una pipeta de 10 mililitros para desechar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el pellet en el volumen residual de solución.
Añadir 20 mililitros de PBS-BSA frío y centrifugar las células de nuevo. Al final de la centrifugación, coloque el tubo en un estante, colocado sobre hielo y transfiera ocho microlitros de los eritrocitos lavados en un tubo de 50 mililitros que contenga tres mililitros de PBS-BSA. A continuación, mezcle los eritrocitos suavemente girando para obtener una suspensión celular homogénea.
Para la inmunosuculación de eritrocitos, transfiera cuidadosamente 100 microlitros de los eritrocitos diluidos a tubos individuales de 1,5 mililitros y recoja los glóbulos rojos por centrifugación. Después de desechar los sobrenadantes, agregue cuidadosamente 20 microlitros de una concentración de 0,5 microgramos por microlitro de anticuerpos anti-CR1 J3D3 biotinilados en PBS-BSA, directamente a cada pellet. Agregue 20 microlitros de tampón PBS-BSA solo a las células de control negativos con una mezcla suave e incubar las muestras durante 45 minutos a cuatro grados centígrados.
Al final de la incubación, lave las muestras dos veces con 750 microlitros de PBS-BSA fresco por tubo, por lavado. Después del segundo lavado, añadir 20 microlitros de uno a 10 dilución de fitotrepavitina fitoerythrin en PBS-BSA a cada tubo con mezcla suave, e incubar las muestras durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lave las muestras dos veces, como se ha demostrado.
Después del segundo lavado, fije cada pellet de muestra de célula con 450 microlitros de tampón de fijación durante el vórtice, antes de transferir cada muestra a tubos inferiores redondos de cinco mililitros individuales durante hasta 48 horas de almacenamiento a cuatro grados centígrados. Para analizar los eritrocitos inmunotenidos para la citometría de flujo, haga clic en el nuevo botón de experimento en el citometro de flujo y cambie el nombre del nuevo experimento. Seleccione la dispersión hacia delante, la dispersión lateral y el PE en la ventana de configuración del citómetro.
En el experimento abierto, seleccione la configuración de la aplicación de configuración del citometro y cree una hoja de trabajo global, utilizando las cajas grises y los pelos cruzados para guiar la optimización. Una vez establecidos todos los parámetros, cargue el tubo de control no manchado en el citometro y ejecute la adquisición, optimizando los voltajes de dispersión hacia delante y lateral para eliminar los residuos y asegurarse de que la población de interés está a escala. A continuación, dibuje una puerta alrededor de los glóbulos rojos en la gráfica de dispersión hacia delante frente a lado y muestre la población de glóbulos rojos en la gráfica de puntos de fluorescencia de PE.
Si las poblaciones positivas están a escala, cargue el tubo de control manchado en el citómetro y ejecute la adquisición. Para registrar y analizar muestras, descargue la muestra manchada y cree una gráfica de dispersión hacia delante frente a lado y un histograma de fluorescencia de PE en una nueva hoja de trabajo global. Cargue la primera muestra en el citometro, ejecute la adquisición y dibuje una puerta de glóbulos rojos alrededor de los eritrocitos en la gráfica de dispersión hacia adelante frente a lado.
Muestre la población de glóbulos rojos en el histograma de fluorescencia de PE y, en la pestaña de estadísticas, seleccione la media para los parámetros de fluorescencia de PE en las poblaciones de glóbulos rojos. En el panel de adquisición, seleccione todos los eventos en la puerta de detención y 10.000 eventos para registrar y haga clic en los datos de registro. Cuando se haya completado la grabación del evento, retire el tubo del citometro.
Las gráficas de hoja de cálculo global deben tener el aspecto que se ilustra. El análisis citométrico de flujo de eritrocitos inmunotenidos de tres sujetos de densidades CR1 conocidas permite medir la intensidad media de fluorescencia del etiquetado para cada sujeto. La gráfica de una curva utilizando los valores del sujeto con la densidad conocida de eritrocitos CR1 permite que estos datos se notifiquen como una función de la intensidad media de fluorescencia.
La comparación de la línea de regresión resultante de esta curva con los valores de la intensidad media de fluorescencia de los otros sujetos permite determinar su densidad de eritrocitos CR1. Tenga cuidado de que los eritrocitos y anticuerpos estén distribuidos correctamente, por lo que las curvas de calibración de las muestras experimentadas en el control negativo están dentro del rango de los ajustes del citómetro. Es posible adaptar este procedimiento para medir otros receptores celulares de densidad, simplemente cambiando el anticuerpo primario y/o adaptando las capas de amplificación.
Siempre que esté manejando sangre, existe el riesgo de contaminación por patógenos. Por lo tanto, asegúrese de utilizar buenas prácticas de laboratorio y de usar el equipo de protección personal adecuado.
