Bu protokol ilgi hücresel reseptör üzerinde antijenik sitelerin sayısını ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük yoğunlukta ifade edilen reseptörler için bile sağlam sonuçlar üretmesidir. Bu yöntem CR1 eritrosit ekspresyonunun azaltılmasının değerlendirilmesini sağlar ve bu alzheimer, sistemik lupus eritematosus, AIDS ve sıtma gibi.
Bu protokol hücre reseptör yoğunluğunun herhangi bir analizi için yararlıdır ve aynı zamanda floresan mikroskobu ile hücre reseptör ekspresyonu çalışmasına uygulanabilir. Hücre ve antikor dağılımı sırasında tüplerin aralıklarını ve mümkünse ilk analizsırasında bir sitometrik uzman eşliğinde olmamızı öneririz. Akış sitometrisi ile immünboyama ve yoğunluk niceliğinin görsel gösterimi, analiz parametrelerinin nasıl doğru ayarlanıncayakadar ının anlaşılması açısından önemlidir.
Analize başlamadan önce, kan depolama tüplerinden 250 mikrolitre sodyum EDTA antikoagüle tam kan ekleyin ve 20 mililitrelik dört derece Santigrat PBS-BSA içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Tüp içeriğini nazik bir şekilde ters çevirerek karıştırın ve hücreleri santrifüj le döndürün. Supernatant atmak ve dikkatle çözelti kalıntı hacminde pelet askıya almak için 10 mililitrelik pipet kullanın.
20 mililitre soğuk PBS-BSA ekleyin ve hücreleri tekrar santrifüj edin. Santrifüjsonunda, tüpü buzüzerine yerleştirilen bir rafa yerleştirin ve yıkanmış eritrositlerin sekiz mikrolitresini pbs-BSA'nın üç mililitresini içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için yavaşça dönerek eritrositleri karıştırın.
Eritrosit immünostaining için, dikkatle bireysel 1.5 mililitre tüpler içine seyreltilmiş eritrositlerin 100 mikrolitre transfer ve santrifüj ile kırmızı kan hücreleri toplamak. Supernatants attıktan sonra, dikkatle her pelet doğrudan, PBS-BSA biyotinylated anti-CR1 J3D3 antikor mikrolitre konsantrasyonu başına 0,5 mikrogram 20 mikrolitre ekleyin. 20 mikrolitre PBS-BSA tamponu tek başına negatif kontrol hücrelerine nazik karıştırma ile ekleyin ve dört santigrat derecede 45 dakika boyunca örnekleri kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, numuneleri tüp başına 750 mikrolitre taze PBS-BSA ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, PBS-BSA'daki streptavidin phycoerythrin'in 1 ila 10 seyreltmesinin 20 mikrolitresini nazik karıştırma yla her tüpe ekleyin ve numuneleri 45 dakika boyunca 45 derece santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, örnekleri gösterildiği gibi iki kez yıkayın.
İkinci yıkamadan sonra, her bir hücre numunesi peletini girdap sırasında 450 mikrolitre fiksasyon tamponu yla sabitleyerek, her numuneyi dört santigrat derecede 48 saate kadar ayrı beş mililitrelik yuvarlak alt tüplere aktarın. Akış sitometrisi için immünosirositleri analiz etmek için akış sitometresinde yeni deney düğmesini tıklayın ve yeni deneyin adını yeniden adlandırın. Sitometre ayarları penceresinde ileri dağılım, yan dağılım ve PE'yi seçin.
Açık denemede, sitometre ayarları uygulama ayarlarını seçin ve optimizasyona rehberlik etmek için gri kutuları ve çapraz kılları kullanarak genel bir çalışma sayfası oluşturun. Tüm parametreler ayarlandığında, lekesiz kontrol tüpünü sitometreye yükleyin ve enkazı ortadan kaldırmak ve ilgi popülasyonunun ölçekte olmasını sağlamak için ileri ve yan dağılım gerilimlerini optimize ederek satın almayı çalıştırın. Daha sonra, ileri karşı yan dağılım arsa kırmızı kan hücreleri etrafında bir kapı çizmek ve PE floresan nokta arsa kırmızı kan hücresi popülasyonu görüntülemek.
Pozitif popülasyonlar ölçekteyse, lekeli kontrol tüpünü sitometreye yükleyin ve edinimi çalıştırın. Örnekleri kaydetmek ve analiz etmek için, lekeli örneği boşaltın ve yeni bir küresel çalışma sayfasında ileriye karşı yan dağılım çizimi ve PE floresan histogramı oluşturun. İlk örneği sitometreye yükleyin, ediniyi çalıştırın ve ileri ve yan dağılım çiziminde eritrositlerin etrafına kırmızı kan hücresi kapısı çizin.
PE floresan histogramında ve istatistik sekmesi altında kırmızı kan hücresi popülasyonunu görüntüleyin, kırmızı kan hücresi popülasyonlarında PE floresan parametrelerinin ortalamasını seçin. Satınalma panosunda, kayıt için durdurma kapısındaki tüm olayları ve kaydetmek için 10.000 olayı seçin ve verileri tıklatın. Olay kaydı tamamlandığında, tüpü sitometreden çıkarın.
Genel çalışma sayfası çizimleri resimli olarak görünmelidir. Bilinen CR1 yoğunluklarının üç deneğinden immünostained eritrositlerin akış sitometrik analizi, her bir denek için etiketlemenin ortalama floresan yoğunluğunun ölçülmesine olanak sağlar. Eritrosit CR1'in bilinen yoğunluğu ile öznedeğerlerini kullanarak bir eğri çizmek, bu verilerin ortalama floresan yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak raporlanmasına olanak tanır.
Bu eğriden kaynaklanan regresyon çizgisinin diğer deneklerin ortalama floresan yoğunluğu değerleri ile karşılaştırılması CR1 eritrosit yoğunluğunun belirlenmesine olanak sağlar. Eritrositlerin ve antikorların düzgün bir şekilde dağıtıldıklarına dikkat edin, böylece negatif kontrol üzerinde denenen numunelerin kalibrasyon eğrileri sitometre ayarlarının menzili içinde dir. Bu prosedürü, sadece birincil antikor değiştirerek ve/veya amplifikasyon tabakalarını uyarlayarak diğer yoğunluklu hücresel reseptörleri ölçmek için uyarlamak mümkündür.
Ne zaman kan la ilgileniyorsanız, patojen kontaminasyon riski vardır. Bu nedenle, iyi laboratuvar uygulamaları kullanmak ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek emin olun.
