سنصف طريقة ميكروباتترن أحادية الخلايا الخالية من الخلايا الأحادية القائمة على الاستنسل، تتغلب على العديد من العقبات المرتبطة بالطباعة الحجرية الضوئية والطباعة الحجرية الناعمة. الاستنسل قابلة لإعادة الاستخدام والعملية غير مكلفة وقابلة للتخصيص. فتحت هذه الطريقة وسيلة جديدة للباحثين غير المهندسين لدراسة شكل الخلايا وchanotransduction الناجمة عن المنطقة في سياقات مختلفة الفسيولوجية والمرضية.
وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول لmicropatterning من الآلاف من الخلايا التي يمكن استخدامها لفحص المخدرات عالية الإنتاجية والنمذجة المرض في طبق. سوف مظاهرة البصرية تسهيل زرع خطوتين حاسمة: مفرزة من الأغطية من هيدروجيل، وتجفيف الهيدروجيل بما فيه الكفاية قبل وضع الاستنسل. إعداد حل البولي أكريلاميد هيدروجيل في أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي من البروبيلين 50 ملليلتر كما هو موضح في المخطوطة.
بعد ذلك ، لإعداد محلول 5٪ من الضوئيات ، قم بحل المكونات في 700 ميكرولترات من الإيثانول بنسبة 100٪. المكونات ليست قابلة للذوبان في الماء لذا تأكد من أن تذوب تماما من قبل دوامة. إضافة 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لحجم النهائي من ملليلتر واحد.
العمل على الجليد، وتمييع الطابق السفلي غشاء مصفوفة البروتين الأسهم حل مع الجليد بارد DMEM F12 وسائل الإعلام أو 1X PBS إلى نسبة التخفيف الأمثل. الحفاظ على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق. عند العمل مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي، تأكد من العمل دائما على الجليد واستخدام حلول الجليد الباردة في النصائح والميصة المبردة وأنابيب.
ضع مصباح بدلاء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية. المقبل، ضع الأفلام البارافين تعقيم أعدت سابقا. إذا كانت أفلام البارافين ليست جافة تماما، استخدم نظام التطلع فراغ لإزالة أي السائل المتبقية.
باستخدام ملقط autoclaved، ضع ستة يغطي autoclaved على فيلم البارافين ستة في كل طبق بيتري. لإعداد حل البولي أكريلاميد للأشعة فوق البنفسجية القابلة للربط، تمييع محلول الضوئي مع حل السلائف الهيدروجيل البوليكريلاميد. تعقيم الحل باستخدام وحدة تصفية 50 ملليلتر مع حجم مسام ميكرومتر 0.22.
ثم الاستغناء 200 ميكرولترات من الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط بوليكريلاميد الحل النهائي على كل من يغطي الزجاج الستة في أطباق بيتري. باستخدام ملقط ذاتية التكفا، قم بتغطية كل غطاء بعناية مع غطاء ثاني ينبس طبقة من الحل بين الأغطية. ضع أطباق بيتري التي تحتوي على الأغطية تحت مصباح مقاعد البدلاء للأشعة فوق البنفسجية مع الغطاء غير المغلق.
تغطية ورقة بيضاء على سطح غير أبيض مهم للحد من فقدان كثافة الأشعة فوق البنفسجية. للحماية من الأشعة فوق البنفسجية، غطي المصباح بورق الألومنيوم. Photopolymerize الهيدروجيلات البولي اكريلاميد لمدة خمس دقائق.
استخدم شفرة حلاقة لفصل كل زوج من الأغطية بعناية. ملء الخزان الذي يحتوي على ستة مركبات غطاء هيدروجيل مع برنامج تلفزيوني. بعد الشطف لمدة خمس دقائق، والعودة المركبة غطاء هيدروجيل إلى فيلم البارافين في طبق بيتري.
الحصول على أنبوب من Sulfo-SANPAH من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية. إضافة 1، 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مبردة مسبقا إلى الأنبوب ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. الاستغناء عن 200 ميكرولترات من Sulfo-SANPAH المخفف على فيلم البارافين في طبق بيتري.
وضع مركب غطاء هيدروجيل على Sulfo-SANPAH مع الهيدروجيل الاتصال Sulfo-SANPAH. بعد ذلك ، ضع مركبات غطاء هيدروجيل تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية وفضحها لمدة خمس دقائق لتنشيط Sulfo-SANPAH. إذا تحول Sulfo-SANPAH من البرتقالي إلى البني مما يشير إلى نجاح التنشيط والدمج ، انتقل إلى الخطوات التالية في غضون 10 دقائق.
تجديد خزان البولي بروبلين المتاح مع برنامج تلفزيوني جديد. نقل مركبات غطاء هيدروجيل المنشط إلى الخزان وشطفها لفترة وجيزة لإزالة Sulfo-SANPAH غير منضم. ضع مركبات غطاء الهيدروجيل على فيلم البارافين في أطباق بيتري وامسحها بعناية مع مناديل خالية من الوبر العقيمة.
وضع استنسل على رأس كل مركب غطاء هيدروجيل. لضمان ختم محكم بين الاستنسل والمركبة، قم بإزالة الرطوبة الزائدة عن طريق الزبن مع مناديل خالية من الوبر. الاستغناء بعناية عن غشاء الطابق السفلي المخفف مصفوفة حل البروتين وضع 200 ميكرولتر على رأس كل مركب غطاء هيدروجيل.
احتضان الانشاءات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، نقل المركبات إلى لوحة ستة جيدا. يمكن التحقق من صحة الختم الضيق بين الهيدروجيل والاستنسل بسهولة من خلال ملاحظة ما إذا كان قد تم الاحتفاظ بمحلول بروتين المصفوفة على قمة الاستنسل.
الفشل في تشكيل ختم ضيق يؤدي إلى تسرب سريع من محلول البروتين من خلال الثقوب. غمر تماما المركبات في برنامج تلفزيوني. باستخدام ملاقط autoclaved، فصل بعناية الاستنسل من الهيدروجيلس دون تمزيق الهيدروجيل.
إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار وإعادة ملء الآبار مع DMEM. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد إزالة لوحة من الحاضنة، فحص DMEM.
إذا DMEM غير غائم، وhydlip مركبات هيدروجيل جاهزة للاستخدام في طلاء الخلايا. كانت قوالب الاستنسل ملفقة تحتوي على صفائف من المربعات والمستطيلات. تم إنشاء ركائز هيدروجيل micropatterned من الاستنسل وتم الحصول على جزر من البروتين المصفوفة.
كما تم الحصول على جزر الخلية. على سبيل المثال، جزر من الخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية التي يسببها الإنسان. ماتريكس تركيز البروتين لعبت دورا أساسيا في توليد أنماط السليم.
أدى التركيز الأمثل إلى توزيع متجانس للبروتينات. أدت تركيزات محلول البروتين المصفوفة دون الأمثل إلى نقش دون المستوى الأمثل. من الضروري استخدام الجانب الأمامي من الاستنسل.
إذا تم استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل ، فإن حجم الجزر البروتينية المصفوفة يزيد بسبب اتجاه القطع بالليزر. أثناء استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل لم يؤثر بشكل كبير على عرض النقوش المستطيلة، زاد الارتفاع بشكل كبير مما أدى إلى انخفاض في نسبة العرض إلى الارتفاع المقصودة. تم تطبيق النقش القائم على الاستنسيل على ركائز ميسترومر السيليكون.
تم تصور الخلايا القلبية المنقوشة على ركائز ميسترومر السيليكون من خلال الكيمياء المناعية للتروبونات القلبية T في التكبير المنخفض وعن طريق البروتين الساركميري ألفا أكتينين في التكبير العالي. تم تطبيق النقش القائم على الاستنسل أيضًا على نمط اثنين من الخلايا القلبية جنباً إلى جنب على الهيدروجيل مع تصلبات مختلفة. وقد جعل اكتشاف الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وبروتوكولات التمايز المقابلة لها نموذجًا بشريًا مثاليًا في المختبر لدراسة تولد النسل والأمراض.
ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية لاستخدام نظام IPS هو عدم وجود هيكل للبيئة الدقيقة التي لديها تركيبة كيميائية حيوية معينة وتصلب للتفاعل مع الخلايا. ويمكن الجمع بين النقش مع المجهر قوة الجر والجر المقايسات المناعيةchemistry لتوصيف هيكل ووظيفة عضلة القلب. تحليل أنواع الخلايا المشتقة من IPS ، في حالاتنا cardiomyocyte ، في مورفولوجيا أكثر فسيولوجية يفتح الفرص لدراسة cardiomyocytes الصعبة في طبق الثقافة.
ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على العديد من النظم الأخرى مثل ولوحات فحص المحتوى العالي. يمكن ضبط الشكل والركيزة بسهولة إلى التطبيق.
