Describiremos un método de micropatrón de células únicas sin litografía basada en plantillas que supera muchos obstáculos asociados con la fotolitografía y la litografía suave. Las plantillas son reutilizables y el proceso es barato y personalizable. Este método abrió una nueva vía para que los investigadores no ingenieros estudiaran la forma celular y la mecanotransducción inducida por el área en diversos contextos fisiológicos y patológicos.
Además, este protocolo permite la micropatrnografía de miles de células que se pueden utilizar para el cribado de fármacos de alto rendimiento y el modelado de enfermedades en un plato. La demostración visual facilitará la implantación de dos pasos cruciales: desprendimiento de cubreobjetos del hidrogel, secado del hidrogel lo suficiente antes de colocar la plantilla. Preparar la solución de hidrogel de poliacrilamida en un nuevo tubo de centrífuga de propileno de 50 mililitros como se describe en el manuscrito.
A continuación, para preparar la solución 5%fotoiniciador, disolver los ingredientes en 700 microlitros de 100% etanol. Los ingredientes no son solubles en agua, así que asegúrese de disolver completamente por vórtice. Añadir 300 microlitros de PBS para un volumen final de un mililitro.
Trabajando en hielo, diluir la solución de proteína de matriz de membrana sótano con medios DMEM F12 fríos o 1X PBS a la relación de dilución optimizada. Mantener sobre hielo para su uso posterior. Cuando trabaje con la matriz de membrana del sótano, asegúrese de trabajar siempre en hielo y utilice soluciones heladas en puntas y tubos de pipeta refrigerados.
Coloque una lámpara de banco UV en una campana de seguridad biológica. A continuación, coloque las películas de parafina esterilizadas preparadas previamente. Si las películas de parafina no están completamente secas, utilice un sistema de aspiración al vacío para eliminar cualquier líquido residual.
Usando fórceps autoclavados, coloca seis cubreobjetos autoclaves en la película de parafina seis en cada plato de Petri. Para preparar la solución final de poliacrilamida reticulable UV, diluya la solución de fotoiniciador con la solución precursora de hidrogel de poliacrilamida. Esterilice la solución utilizando una unidad de filtro de 50 mililitros con un tamaño de poro de 0,22 micrómetros.
A continuación, dispensar 200 microlitros de solución final de poliacrilamida reticulable UV en cada uno de los seis cubreobjetos de vidrio en los platos Petri. Usando fórceps autoclavados, cubra cuidadosamente cada cubreobjetos con un segundo cubreobjetos que atrapa una capa de la solución entre los dos cubreobjetos. Coloque los platos Petri que contengan los cubreobjetos debajo de la lámpara de banco UV con la tapa sin cerrar.
La cobertura del papel blanco en la superficie no blanca es importante para minimizar la pérdida de intensidad UV. Para la protección contra la radiación UV, cubra la lámpara con papel de aluminio. Fotopolimerizar los hidrogeles de poliacrilamida durante cinco minutos.
Utilice una cuchilla de afeitar para separar cuidadosamente cada par de cubreobjetos. Llene el depósito que contiene seis compuestos de cubierta de hidrogel con PBS. Después de enjuagar durante cinco minutos, devuelva los compuestos de cubierta de hidrogel a la película de parafina en el plato Petri.
Obtenga un tubo de Sulfo-SANPAH del almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Agregue 1.200 microlitros de PBS preenfriado al tubo y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Dispensar 200 microlitros del Sulfo-SANPAH diluido en la película de parafina en el plato Petri.
Coloque un compuesto de cubierta de hidrogel sobre el Sulfo-SANPAH con el hidrogel en contacto con el Sulfo-SANPAH. A continuación, coloque los compuestos de cubierta de hidrogel bajo la lámpara UV y exponga durante cinco minutos para activar el Sulfo-SANPAH. Si el Sulfo-SANPAH pasa de naranja a marrón indicando la activación y la incorporación correctas, continúe con los siguientes pasos en 10 minutos.
Reponer el depósito de polipropileno desechable con PBS fresco. Transfiera los compuestos de cubierta de hidrogel activado al depósito y enjuáguelos brevemente para eliminar sulfo-SANPAH sin consolidar. Coloque los compuestos de cubierta de hidrogel en la película de parafina en los platos de Petri y délos cuidadosamente con toallitas estériles sin pelusas.
Coloque una plantilla encima de cada compuesto de cubierta de hidrogel. Para asegurar un sellado hermético entre la plantilla y el compuesto, elimine el exceso de humedad mediante el uso de toallitas sin pelusas autoclaves. Dispensar cuidadosamente la solución diluida de proteína de matriz de membrana del sótano colocando 200 microlitros encima de cada compuesto de cubierta de hidrogel.
Incubar las construcciones durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, transfiera los compuestos a una placa de seis pozos. Un sello hermético entre el hidrogel y la plantilla se puede validar fácilmente observando si la solución proteica de matriz se ha retenido en la parte superior de la plantilla.
Si no se forma un sello hermético, se produce una fuga rápida de la solución proteica a través de los orificios. Sumerja completamente los compuestos en PBS. Usando pinzas autoclaves, desenganche cuidadosamente las plantillas de los hidrogeles sin romper los hidrogeles.
Retire el PBS de los pozos y rellene los pozos con DMEM. Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados. Después de retirar la placa de la incubadora, examine el DMEM.
Si el DMEM no está turbio, los compuestos de cubierta de hidrogel están listos para ser utilizados para el recubrimiento celular. Se fabricaron plantillas que contenían matrices de cuadrados y rectángulos. Se crearon sustratos de hidrogel micropatrón a partir de las plantillas y se obtuvieron islas de proteína de matriz.
También se obtuvieron islas celulares. Por ejemplo, islas de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre. La concentración de proteínas de la matriz desempeñó un papel esencial en la generación de patrones adecuados.
Una concentración óptima condujo a una distribución homogénea de proteínas. Las concentraciones subópttimas de la solución de proteína de matriz dieron lugar a un patrón subóptimo. Es fundamental utilizar la parte frontal de la plantilla.
Si se utiliza la parte posterior de la plantilla, el tamaño de las islas de proteína de matriz aumenta debido a la dirección del corte por láser. Si bien el uso de la parte posterior de la plantilla no afectó significativamente a la anchura de los patrones rectangulares, la altura aumentó significativamente, lo que llevó a una reducción en la relación de aspecto prevista. El patrón basado en plantillas se aplicó a sustratos de elastómero de silicio.
Los cardiomiocitos estampados en sustratos de elastómero de silicio fueron visualizados por inmunocitoquímica de troponina cardiaca T a bajo aumento y por proteína sarcomerica alfa-actinina con alto aumento. El patrón basado en la plantilla también se aplicó para modelar dos cardiomiocitos uno al lado del otro en hidrogeles con diferentes rigidezes. El descubrimiento de células madre pluripotentes inducidas por el hombre y los correspondientes protocolos de diferenciación lo han convertido en un modelo humano in vitro ideal para el estudio de la oncogénesis y la patogénesis.
Sin embargo, una limitación importante del uso del sistema IPS es la ausencia de estructura en el microambiente que tiene una composición y rigidez bioquímica particulares para interactuar con las células. El patrón se puede combinar con microscopía de fuerza de tracción y ensayos de inmunocitoquímica para caracterizar la estructura y función de los cardiomiocitos. El análisis de los tipos de células derivadas de IPS, en nuestro caso cardiomiocitos, en una morfología más fisiológica abre oportunidades para estudiar cardiomiocitos desafiantes en el plato de cultivo.
La técnica también se puede aplicar a muchos otros sistemas, como las placas de cribado de alto contenido. La forma y el sustrato se pueden ajustar fácilmente a la aplicación.
