Nous décrirons une méthode de micropatrin monocellule sans lithographie à base de pochoir qui surmonte de nombreux obstacles associés à la photolithographie et à la lithographie douce. Les pochoirs sont réutilisables et le processus est peu coûteux et personnalisable. Cette méthode a ouvert une nouvelle voie pour les chercheurs non-ingénieurs pour étudier la forme cellulaire et la mécanotransduction induite par la région dans divers contextes physiologiques et pathologiques.
En outre, ce protocole permet la micropatrisation de milliers de cellules qui peuvent être utilisées pour le dépistage des médicaments à haut débit et la modélisation des maladies dans un plat. La démonstration visuelle facilitera l’implantation de deux étapes cruciales : le détachement du coverslip de l’hydrogel, le séchage de l’hydrogel suffisamment avant de placer le pochoir. Préparez la solution hydrogel en polyacrylamide dans un nouveau tube de centrifugeuse propylène de 50 millilitres tel que décrit dans le manuscrit.
Ensuite, pour préparer la solution photoinitiateur à 5 %, dissoudre les ingrédients dans 700 microlitres de 100 % d’éthanol. Les ingrédients ne sont pas solubles dans l’eau alors assurez-vous de dissoudre complètement par vortex. Ajouter 300 microlitres de PBS pour un volume final d’un millilitre.
Travailler sur la glace, diluer la solution de stock protéique de la matrice membranaire du sous-sol avec des supports de DMEM F12 glacés ou 1X PBS au rapport de dilution optimisé. Garder sur la glace pour une utilisation ultérieure. Lorsque vous travaillez avec la matrice membranaire du sous-sol, assurez-vous de toujours travailler sur la glace et d’utiliser des solutions glacées dans des pointes et des tubes de pipette réfrigérés.
Placez une lampe de banc UV dans un capot de sécurité biologique. Ensuite, placez les films de paraffine stérilisés préparés précédemment. Si les films de paraffine ne sont pas complètement secs, utilisez un système d’aspiration sous vide pour éliminer tout liquide résiduel.
À l’aide de forceps autoclavés, placer six couvre-pièces autoclavés sur le film de paraffine six dans chaque boîte de Petri. Pour préparer la solution finale de polyacrylamide interdé linkable UV, diluez la solution photoinitiateur avec la solution précurseur du polyacrylamide hydrogel. Stériliser la solution à l’aide d’une unité de filtre de 50 millilitres avec une taille de pore de 0,22 micromètre.
Distribuez ensuite 200 microlitres de solution finale de polyacrylamide interdélindible UV sur chacune des six couvertures de verre dans les boîtes de Petri. À l’aide de forceps autoclavés, couvrir soigneusement chaque coverslip d’un deuxième coverslip piégeant une couche de la solution entre les deux coverslips. Placez les boîtes de Pétri contenant les couvre-pièces sous la lampe de banc UV avec le couvercle non fermé.
La couverture du livre blanc sur la surface non blanche est importante pour minimiser la perte d’intensité UV. Pour vous protéger contre les rayons UV, recouvrez la lampe de papier d’aluminium. Photopolymériser les hydrogels de polyacrylamide pendant cinq minutes.
Utilisez une lame de rasoir pour séparer soigneusement chaque paire de coverslips. Remplissez le réservoir contenant six composites hydrogel coverslip avec PBS. Après le rinçage pendant cinq minutes, retourner les composites de coverslip hydrogel au film de paraffine dans la boîte de Petri.
Obtenez un tube sulfo-SANPAH de stockage à moins 80 degrés Celsius. Ajouter 1 200 microlitres de PBS pré-réfrigérés au tube et mélanger en pipetant de haut en bas. Distribuez 200 microlitres du Sulfo-SANPAH dilué sur le film de paraffine dans la boîte de Petri.
Placez un composite de coverslip hydrogel sur le Sulfo-SANPAH avec l’hydrogel contactant le Sulfo-SANPAH. Ensuite, placez les composites hydrogel coverslip sous la lampe UV et exposez-les pendant cinq minutes pour activer le Sulfo-SANPAH. Si le Sulfo-SANPAH passe de l’orange au brun indiquant une activation et une incorporation réussies, passez aux étapes suivantes dans les 10 minutes.
Reconstituer le réservoir jetable de polypropylène avec du PBS frais. Transférez les composites de coverslip hydrogel activés au réservoir et rincez-les brièvement pour enlever sulfo-SANPAH non lié. Placez les composites hydrogel coverslip sur le film de paraffine dans les boîtes de Petri et tamponnez-les soigneusement avec des lingettes stériles sans peluche.
Placer un pochoir sur chaque composite de coverslip hydrogel. Pour assurer un joint étanche entre le pochoir et le composite, éliminez l’excès d’humidité en tamponnant avec des lingettes autoclavées sans peluche. Distribuez soigneusement la solution de protéine matricielle membranaire diluée du sous-sol en plaçant 200 microlitres au-dessus de chaque composite de coverslip hydrogel.
Incuber les constructions pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, transférez les composites dans une assiette de six puits. Un joint étanche entre l’hydrogel et le pochoir peut être facilement validé en observant si la solution protéique matricielle a été conservée au-dessus du pochoir.
Le défaut de former un joint étanche entraîne une fuite rapide de la solution protéique à travers les trous. Plongez complètement les composites dans PBS. À l’aide d’une pince autoclavée, détachez soigneusement les pochoirs des hydrogels sans déchirer les hydrogels.
Retirez le PBS des puits et remplissez les puits avec du DMEM. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré la plaque de l’incubateur, examiner le DMEM.
Si le DMEM n’est pas nuageux, les composites hydrogel coverslip sont prêts à être utilisés pour le placage cellulaire. Des pochoirs ont été fabriqués contenant des rangées de carrés et de rectangles. Des substrats hydrogel micropatternés ont été créés à partir des pochoirs et des îlots de protéines matricielles ont été obtenus.
Des îles cellulaires ont également été obtenues. Par exemple, des îlots de cardiomyocytes pluripotents d’origine humaine dérivés de cellules souches. La concentration de protéines matricielles a joué un rôle essentiel dans la génération de modèles appropriés.
Une concentration optimale a conduit à une distribution homogène des protéines. Les concentrations de solutions protéiques matricielles sous-optimales ont conduit à des modelages sous-optimaux. Il est essentiel d’utiliser le côté avant du pochoir.
Si l’arrière du pochoir est utilisé, la taille des îlots protéiques matricielles augmente en raison de la direction de la découpe au laser. Bien que l’utilisation du côté arrière du pochoir n’ait pas eu d’incidence significative sur la largeur des motifs rectangulaires, la hauteur a considérablement augmenté, ce qui a réduit le rapport d’aspect prévu. Le modelage à base de pochoir a été appliqué sur les substrats élastomères en silicium.
Les cardiomyocytes modelés sur des substrats d’élastomère de silicium ont été visualisés par immunocytochimie de troponine cardiaque T à faible grossissement et par alpha-actinin de protéine sarcomeric à grossissement élevé. Le modelage à base de pochoir a également été appliqué pour modeler deux cardiomyocytes côte à côte sur des hydrogels avec des rigidités différentes. La découverte de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et les protocoles de différenciation correspondants en ont fait un modèle humain in vitro idéal pour étudier l’oncogenèse et la pathogénie.
Cependant, une limitation majeure de l’utilisation du système IPS est l’absence de structure au microenvironnement qui a une composition biochimique particulière et la rigidité d’interagir avec les cellules. Le modelage peut être combiné avec la microscopie de force de traction et les essais d’immunocytochimie pour caractériser la structure et la fonction des cardiomyocytes. L’analyse des types de cellules dérivées de l’IPS, dans notre cas cardiomyocyte, dans une morphologie plus physiologique ouvre des possibilités d’étudier les cardiomyocytes stimulants dans le plat de culture.
La technique peut également être appliquée à de nombreux autres systèmes tels que et les plaques de criblage à haute teneur. La forme et le substrat peuvent être facilement ajustés à l’application.
