우리는 포토리소그래피 및 부드러운 리소그래피와 관련된 많은 장애물을 극복하는 스텐실 기반 리소그래피 가 없는 단세포 마이크로패턴 방법을 설명합니다. 스텐실은 재사용 가능하며 프로세스는 저렴하고 사용자 정의 할 수 있습니다. 이 방법은 비 엔지니어 연구원이 다양한 생리학적 및 병리학 적 맥락에서 세포 모양과 지역 유도 된 메카노 트랜스듀션을 연구할 수있는 새로운 길을 열었습니다.
더욱이, 이 프로토콜은 접시에 있는 높은 처리량 약 검열 및 질병 모델링을 위해 이용될 수 있는 세포의 수천의 마이크로패터닝을 허용합니다. 시각적 데모는 두 가지 중요한 단계의 이식을 용이하게합니다 : 하이드로겔에서 커버 슬립의 분리, 스텐실을 배치하기 전에 충분히 하이드로 겔을 건조. 원고에 설명된 바와 같이 새로운 50 밀리리터 프로필렌 원심분리기 튜브에서 폴리아크릴아미드 하이드로겔 용액을 준비한다.
다음으로, 5%의 광원용용액을 준비하기 위해, 100% 에탄올의 700 마이크로리터에 성분을 용해한다. 재료는 용해되지 않으므로 소용돌이에 의해 완전히 녹아 야합니다. PBS 300마이크로리터를 추가하여 1밀리리터의 최종 볼륨을 만드면 됩니다.
얼음, 희석 지하 막 매트릭스 단백질 스톡 솔루션 얼음 차가운 DMEM F12 배지 또는 1X PBS 최적화된 희석 비에. 나중에 사용하기 위해 얼음을 유지하십시오. 지하 멤브레인 매트릭스로 작업할 때는 항상 얼음작업을 하고 차가운 파이펫 팁과 튜브에서 얼음 냉기 솔루션을 사용해야 합니다.
생물학적 안전 후드에 UV 벤치 램프를 놓습니다. 다음으로, 이전에 준비된 멸균 파라핀 필름을 배치합니다. 파라핀 필름이 완전히 건조하지 않은 경우 진공 포부 시스템을 사용하여 잔류 액체를 제거하십시오.
오토클레이브 집게를 사용하여 파라핀 필름 6개에 6개의 오토클레이브 커버립을 배치합니다. UV 교차 연결 폴리아크라이알라미드 최종 용액을 준비하려면 폴리아크릴아미드 하이드로겔 전구체 용액으로 광리니티에이터 용액을 희석합니다. 0.22 마이크로미터 모공 크기의 50 밀리리터 필터 장치를 사용하여 용액을 살균합니다.
그런 다음 페트리 접시의 6개의 유리 커버립에 UV 교차 연결 가능한 폴리아크릴라미드 최종 용액 200마이크로리터를 분배합니다. 자동 식 포셉을 사용하여 두 개의 커버슬립을 두 커버슬립으로 조심스럽게 덮어 두 커버립 사이에 솔루션 레이어를 트래핑합니다. 뚜껑을 닫지 않은 UV 벤치 램프 아래에 커버립이 들어 있는 페트리 접시를 놓습니다.
비백색 표면에 백서의 범위는 UV 강도 손실을 최소화하는 것이 중요합니다. 자외선으로부터 보호하기 위해 램프를 알루미늄 호일로 덮습니다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 5분간 광중합한다.
면도날을 사용하여 각 커버립을 조심스럽게 분리합니다. PBS로 6개의 하이드로겔 커버슬립 복합재가 들어 있는 저장소를 채웁니다. 5분 동안 헹구고, 하이드로겔 커버슬립 복합재를 페트리 접시의 파라핀 필름으로 되돌리십시오.
영하 80도의 저장에서 설포-SANPAH 튜브를 획득하십시오. 미리 냉각된 PBS 1, 200마이크로리터를 튜브에 넣고 위아래로 파이프를 섞어 섞습니다. 희석된 설포-SANPAH의 마이크로리터 200대를 페트리 접시의 파라핀 필름에 분배합니다.
Sulfo-SANPAH에 하이드로겔 커버슬립 복합재를 배치하여 술포-산파에 접촉하는 하이드로겔을 배치합니다. 다음으로, 하이드로겔 커버슬립 복합재를 UV 램프 아래에 놓고 5분간 노출하여 Sulfo-SANPAH를 활성화시합니다. Sulfo-SANPAH가 주황색에서 갈색으로 바뀌어 성공적으로 활성화되고 통합되는 경우 10분 이내에 다음 단계로 진행하십시오.
일회용 폴리프로필렌 저수지에 신선한 PBS를 보충합니다. 활성화된 하이드로겔 커버슬립 복합재를 저수지로 옮기고 간략하게 헹구어 불구속없는 설포-SANPAH를 제거합니다. 파라핀 필름에 하이드로겔 커버슬립 컴포지트를 페트리 접시에 놓고 멸균 보풀이 없는 물티슈로 조심스럽게 두드려주세요.
각 하이드로겔 커버슬립 컴포지트 위에 스텐실을 놓습니다. 스텐실과 복합체 사이의 단단한 밀봉을 보장하려면 오토클레이브 보풀이 없는 물티슈로 데빙하여 과도한 수분을 제거하십시오. 각 하이드로겔 커버슬립 복합체 위에 200마이크로리터를 배치하는 희석된 지하 막 매트릭스 단백질 용액을 조심스럽게 분배합니다.
하룻밤 사이에 37°C에서 구조물을 배양합니다. 다음 날, 6 웰 플레이트에 복합재를 전송합니다. 하이드로겔과 스텐실 사이의 단단한 씰은 매트릭스 단백질 용액이 스텐실 위에 유지되었는지 여부를 관찰하여 쉽게 검증할 수 있습니다.
단단한 씰을 형성하지 못하면 구멍을 통해 단백질 용액이 빠르게 누출됩니다. PBS의 복합소재를 완전히 침지합니다. 오토클레이브 핀셋을 사용하여 하이드로겔을 찢지 않고 하이드로겔에서 스텐실을 조심스럽게 분리합니다.
우물에서 PBS를 제거하고 DMEM으로 우물을 다시 채웁니다. 하룻밤 동안 접시를 섭씨 37도에서 배양하십시오. 인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후 DMEM을 검사합니다.
DMEM이 흐리지 않으면 하이드로겔 커버슬립 복합재를 세포 도금에 사용할 준비가 되어 있습니다. 스텐실은 사각형과 사각형배열을 포함하도록 제작되었습니다. 마이크로패턴 하이드로겔 기판은 스텐실과 매트릭스 단백질의 섬에서 생성되었다.
셀 섬도 수득하였다. 예를 들어, 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포의 섬. 매트릭스 단백질 농도는 적절한 패턴을 생성하는 데 필수적인 역할을했습니다.
최적의 농도는 단백질의 균일한 분포로 이어졌습니다. 최적이 아닌 매트릭스 단백질 용액 농도는 최적이 아닌 패터닝으로 이어졌습니다. 스텐실의 전면을 사용하는 것이 중요합니다.
스텐실의 뒷면이 사용되는 경우, 레이저 절단의 방향에 따라 매트릭스 단백질 제도의 크기가 증가한다. 스텐실의 후면을 사용하는 동안 직사각형 패턴의 폭에 크게 영향을 미치지 는 않았지만, 높이가 크게 증가하여 의도된 종횡비의 감소로 이어졌다. 스텐실 계 패터닝은 실리콘 엘라스토머 기판에 적용되었다.
실리콘 탄성수기 기판에 패턴 된 심근세포는 낮은 배율에서 심장 트로포닌 T의 면역 세포 화학에 의해 그리고 높은 배율에서 육종 단백질 알파 액틴에 의해 시각화되었다. 스텐실 계 의 패터닝은 또한 서로 다른 강성을 가진 하이드로겔에 나란히 2개의 심근세포 패턴에 적용되었다. 인간 유도만능 줄기 세포와 그에 상응하는 분화 프로토콜의 발견은 종양 발생 및 병인을 연구하기위한 시험관 내 인간 모델이상을 만들었습니다.
그러나, IPS 시스템을 사용하는 주요 제한은 세포와 상호작용하는 특정 생화학 적 조성 및 강성을 가지고 미세 환경에 구조의 부재이다. 패터닝은 심근세포의 구조와 기능을 특성화하기 위해 견인력 현미경 검사법과 면역 세포화학 분석술과 결합될 수 있다. IPS 유래 세포 유형의 분석, 우리의 경우 심근 세포, 더 생리적 형태에 문화 접시에 도전적인 심근 세포를 공부 할 수있는 기회를 엽니 다.
이 기술은 또한 높은 함량 선별 판과 같은 많은 다른 시스템에 적용 될 수있다. 형상및기판은 어플리케이션에 쉽게 조정할 수 있다.
