Fotolitografi ve yumuşak litografi ile ilişkili birçok engeli aşan şablon bazlı litografisiz tek hücreli mikrodesen yöntemini açıklayacağız. Şablonlar yeniden kullanılabilir ve süreç ucuz ve özelleştirilebilir. Bu yöntem, mühendis olmayan araştırmacıların çeşitli fizyolojik ve patolojik bağlamlarda hücre şekli ve alana bağlı mekanotransdüksiyonu incelemeleri için yeni bir yol açmıştır.
Ayrıca, bu protokol bir çanak yüksek iş itimi ilaç tarama ve hastalık modelleme için kullanılabilir hücrelerin binlerce mikrodesenleme sağlar. Görsel gösteri iki önemli adımın implantasyonunu kolaylaştıracaktır: kapak kaymasının hidrojelden ayrılması, kalıbı yerleştirmeden önce hidrojelin yeterince kurutulması. El yazmasında açıklandığı gibi yeni bir 50 mililitrelik propilen santrifüj tüp poliakrilamid hidrojel çözeltisi hazırlayın.
Daha sonra, %5 fotoinatör çözeltisini hazırlamak için, malzemeleri %100 etanolün 700 mikrolitresinde çözün. Malzemeler suda çözünür değildir bu yüzden girdap tarafından tamamen çözülür emin olun. Bir mililitrelik son hacim için 300 mikrolitre PBS ekleyin.
Buz üzerinde çalışma, buz soğuk DMEM F12 medya veya 1X PBS ile seyreltik bodrum membran matris protein stok çözeltisi optimize seyreltme oranı. Daha sonra kullanmak için buz üzerinde tutun. Bodrum membran matrisi ile çalışırken, her zaman buz üzerinde çalışmak ve soğutulmuş pipet ipuçları ve tüpler buz soğuk çözeltiler kullandığınızdan emin olun.
Biyolojik bir güvenlik kaputuna uv tezgah lambası yerleştirin. Daha sonra, daha önce hazırlanmış steril parafin filmleri yerleştirin. Parafin filmleri tamamen kuru değilse, artık sıvıyı çıkarmak için bir vakum aspirasyon sistemi kullanın.
Otoklavlı forceps kullanarak, parafin film altı her Petri çanak altı otoklavlı kapakları yerleştirin. UV çapraz bağlanabilir poliakrilamid nihai çözeltisini hazırlamak için, fotoinitiatatör çözeltisini poliakrilamid hidrojel öncül çözeltisi ile seyreltin. 0,22 mikrometre gözenek boyutuna sahip 50 mililitrelik filtre ünitesi ni kullanarak çözeltiyi sterilize edin.
Sonra Petri kaplarında altı cam kapaklarıher üzerine UV çapraz bağlanabilir poliakrilamid nihai çözüm 200 mikrolitre dağıtmak. Otoklavlı forsepskullanarak, her coverslip'i iki kapak arasında çözeltinin bir tabakasını kaplayan ikinci bir kapak kaymasıyla dikkatlice kaplayın. Kapakları içeren Petri kaplarını UV tezgah lambasının altına kapağı kapalı olarak yerleştirin.
Beyaz olmayan yüzeyde beyaz kağıt kapsama UV yoğunluğu kaybını en aza indirmek için önemlidir. UV ışınlarından korunmak için lambayı alüminyum folyo ile kaplayın. Poliakrilamid hidrojelleri beş dakika fotopolimerize edin.
Her bir kapak çiftini dikkatlice ayırmak için bir jilet kullanın. Altı hidrojel coverslip kompozit içeren rezervuarı PBS ile doldurun. Beş dakika durulama sonra, Petri kabındaki parafin filmine hidrojel coverslip kompozitleri geri verin.
Eksi 80 santigrat derecede depodan bir tüp Sulfo-SANPAH alın. Tüpe 1, 200 mikrolitre önceden soğutulmuş PBS ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Petri kabındaki parafin filminüzerine seyreltilmiş Sulfo-SANPAH'ın 200 mikrolitresini dağıtın.
Sulfo-SANPAH'a temas eden hidrojel ile Sulfo-SANPAH üzerine hidrojel coverslip kompozit yerleştirin. Daha sonra, UV lambası altında hidrojel coverslip kompozit yerleştirin ve Sulfo-SANPAH etkinleştirmek için beş dakika maruz. Sulfo-SANPAH başarılı aktivasyon ve birleşme gösteren turuncudan kahverengiye dönerse, 10 dakika içinde sonraki adımlara ilerleyin.
Tek kullanımlık polipropilen hazneyi taze PBS ile yeniler. Aktif hidrojel coverslip kompozitleri rezervuara aktarın ve bağlanmamış Sulfo-SANPAH'ı çıkarmak için kısa bir süre durulayın. Petri tabaklarında parafin filminin üzerine hidrojel coverslip kompozitleri yerleştirin ve steril tiftiksiz mendillerle dikkatlice damlayın.
Her hidrojel coverslip kompozit üstüne bir şablon yerleştirin. Şablon ve kompozit arasında sıkı bir mühür sağlamak için, otoklavsız mendil ile dabbing tarafından aşırı nem kaldırın. Her hidrojel coverslip kompozit üstüne 200 mikrolitre yerleştirerek seyreltilmiş bazal membran matris protein çözeltisi dikkatle dağıtmak.
Yapıları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kompozitleri altı kuyulu bir tabağa aktarın. Hidrojel ve şablon arasındaki sıkı bir mühür, matris protein çözeltisinin şablonun üzerinde tutulup tutulmadığı gözlemlenerek kolayca doğrulanabilir.
Sıkı bir sızdırmazlık yapılmaması protein çözeltisinin deliklerden hızlı bir şekilde sızmasına yol açar. Kompozitleri PBS'ye tamamen batırın. Otoklavlı cımbız kullanarak, hidrojelleri yırtmadan şablonları dikkatlice ayırın.
PBS'yi kuyulardan çıkarın ve kuyuları DMEM ile doldurun. Tabağı bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuvözdeki plakayı çıkardıktan sonra DMEM'i inceleyin.
DMEM bulutlu değilse, hidrojel coverslip kompozitler hücre kaplaması için kullanılmaya hazırdır. Şablonlar kareler ve dikdörtgenler dizileri içeren imal edildi. Mikro desenli hidrojel substratları şablonlardan oluşturuldu ve matris proteinin adalarından elde edildi.
Hücre adaları da elde edildi. Örneğin, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit adaları. Matris protein konsantrasyonu uygun desenleri üreten önemli bir rol oynadı.
Optimal konsantrasyon proteinlerin homojen bir dağılımına yol açtı. Suboptimal matris protein çözeltisi konsantrasyonları suboptimal desenleme yol açtı. Şablonun ön tarafını kullanmak çok önemlidir.
Şablonun arka yüzü kullanılırsa, matris protein adalarının boyutu lazer kesim in yönüne bağlı olarak artar. Şablonun arka tarafını kullanmak dikdörtgen desenlerin genişliğini önemli ölçüde etkilemezken, yükseklik önemli ölçüde artmış ve amaçlanan en boy oranında bir azalmaya yol açmıştır. Silikon elastomer yüzeylere şablon bazlı desenleme uygulandı.
Silikon elastomer substratlar üzerindeki desenli kardiyomiyositler düşük büyütmede kardiyak troponin T immünositokimyası ve yüksek büyütmede sarkonik protein alfa-aktinin ile görselleştirildi. Şablon bazlı desenleme de farklı sertlikleri ile hidrojeller yan yana desen iki kardiyomiyosit uygulandı. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrenin keşfi ve buna karşılık gelen farklılaşma protokolleri, onkogenez ve patogenezi incelemek için ideal bir in vitro insan modeli haline getirmiştir.
Ancak, IPS sistemi kullanarak önemli bir sınırlama belirli biyokimyasal bileşimi ve hücrelerle etkileşim sertliği olan mikroçevreye yapının yokluğudur. Desenleme kardiyomiyositlerin yapısını ve işlevini karakterize etmek için çekiş kuvveti mikroskobu ve immünositokimya testleri ile kombine edilebilir. Ips kaynaklı hücre tiplerinin analizi, bizim durumumuzda kardiyomiyosit, daha fizyolojik morfolojide kültür çanatositlerinde zorlu kardiyomiyositleri inceleme fırsatları açar.
Bu teknik, yüksek içerikli tarama plakaları gibi diğer birçok sistem için de uygulanabilir. Şekil ve substrat uygulamaya kolayca ayarlanabilir.
