تسمح بروتوكولات النواة Hi-C باستكشاف التأكيد الكروموسومي بدقة مختلفة لتوصيف حلقات الكروماتين والمجالات والمقصورة التي تنظم الجينوم. يوفر هذا البروتوكول توصيفا عالي الدقة للتفاعلات الجينومية على نطاقات مختلفة ، مما يؤدي إلى تغطية أكثر اتساقا على النطاق الكامل للمسافات الجينية والبيانات ذات الضوضاء التقنية الأقل. الجمع بين هذا البروتوكول والتحرير الجيني هو استراتيجية قوية لاختبار الوظيفة الهيكلية للعناصر الوراثية.
ويمكن أيضا أن يطبق على توصيف الاختلافات الهيكلية التي تؤدي إلى المرض. يمكن تطبيق بروتوكول النواة Hi-C لاستكشاف تنظيم الجينوم لأي جينوم يوكاريوتيك. يقوم القيام بعلاج SDS وTriton بتصنيف أي كتل نووية عن طريق الأنابيب حيث تتداخل المجاميع مع كفاءة التفاعل الأنزيمي ، وتأكد من تنفيذ مقياس ضوابط الجودة المناسب قبل التسلسل.
ابدأ بإضافة الفورمالديهايد الخالي من الميثانول إلى مرة واحدة 10 إلى خلايا شنايدر السبعة الخط 2 بالإضافة إلى Drosophila في 17.5 ملليلتر من شنايدر المتوسطة تكملها 10٪ FBS إلى تركيز نهائي من 2٪ احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع خلط كل 60 ثانية أو على عجلة دوارة، وإضافة الجليسين إلى تركيز النهائي من 0.125 الضرس مع خلط. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة و 15 دقيقة على الجليد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق بعناية بيليه في 25 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة وجمع الخلايا مع جهاز طرد مركزي آخر. في نهاية الطرد المركزي، إعادة إنفاق الخلايا في ملليلتر واحد من الجليد الباردة تحلل العازلة لعد وضبط الخلايا إلى واحد مرة 10 إلى ست خلايا لكل تركيز ملليلتر.
احتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة، عكس الأنبوب كل دقيقتين لخلط وجمع الخلايا مع جهاز طرد مركزي آخر. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من الجليد الطازج الباردة تحلل العازلة. بعد الطرد المركزي، اغسل اليزلات بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للقيود 1.25X.
الطرد المركزي مرة أخرى لجمع lysate. Resuspend بيليه في 360 ميكرولتر من العازلة تقييد جديدة و 11 ميكرولتر من 10٪ SDS مع الأنابيب بعناية واحتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية و 7 إلى 950 الثورات في الدقيقة الواحدة مع pipetting عرضية. في نهاية الحضانة ، أوقف البيرمابيليشن مع 75 ميكرولتر من السطحي غير الأيونية وأرجع الأنبوب إلى الحاضنة لمدة 45 دقيقة إضافية مع الاهتزاز في 950 ثورة في الدقيقة مع الأنابيب العرضية.
بالنسبة لهضم الكروماتين، أضف 200 وحدة من Mbo1 إلى الأنبوب لاحتضان لمدة أربع إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الدوران. في نهاية الحضانة ، تعطيل الانزيم مع حضانة لمدة 20 دقيقة في 60 درجة مئوية. لملء جزء تقييد يتدلى وتسمية الحمض النووي ينتهي مع البيوتين، إضافة 1.5 ميكرولتر كل من 10 ملليمولار dCTP، dGTP، dTTP، 20 ميكرولتر من 0.4 ملليمولار البيوتين dATP، 17.5 ميكرولتر من ثلاثي منخفض EDTA العازلة، و 10 ميكرولتر من خمس وحدات لكل ميكرولتر من DNAase جزء واحد كبير إلى الأنبوب مع خلط دقيق.
احتضان رد الفعل لمدة 75 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 700 ثورة في الدقيقة كل 10 ثوان لمدة 30 ثانية. في نهاية الحضانة، أضف مزيج الربط إلى الكروماتين وضبطه على حجم تفاعل نهائي واحد ملليلتر مع خلط لطيف وشامل واحتضان بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية. لإضعاف عينة البروتينات، أضف 50 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر بروتيناز K إلى الأنبوب لاحتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، قم بزيادة درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعكس الربط المتبادل للعينة. في صباح اليوم التالي، تتحلل الجيش الملكي النيبالي مع 10 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل ملليلتر RNAAse A.After ساعة واحدة في 37 درجة مئوية، إضافة حجم واحد من الكلوروفورم الفينول إلى الأنبوب ومزيج تماما عن طريق عكس للحصول على مرحلة بيضاء متجانسة. بعد التعجيل بالحمض النووي وفقا للبروتوكولات القياسية ، قم بتحديد الحمض النووي باستخدام صبغة فلورية ترتبط بشكل انتقائي بالحمض النووي ومقياس الفلور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
لتنقية الحمض النووي من aliquots غير المهضوم والمهضوم ، قم بتحميل 100 نانوجرام من العينات غير المهضومة والهضمية والمربطة على هلام agarose بنسبة 1.5٪ والبحث عن مسحة تركزت حول 500 زوج أساسي في العينة المهضومة مقابل نطاق وزن جزيئي مرتفع للعينة المربطة. للتحقق من كفاءة وضع العلامات وربط مرحبا جيم عن طريق تضخيم وهضم تفاعل معروف، بعد PCR، هضم المنتجات مع Mbo1، Cla1، أو كليهما، وتشغيل العينات على هلام 1.5 إلى 2٪ جديدة للسماح بتقدير العدد النسبي للتقاطعات ربط 3C ومرحبا C. بعد sonicating العينة للحصول على 200 إلى 500 شظايا الحمض النووي زوج قاعدة، نقل 130 ميكرولتر مع خمسة ميكروغرام من الحمض النووي من كل عينة إلى أنابيب جديدة للطرد المركزي الدقيق تحتوي على 16 ميكرولتر من العازلة ربط 10X، واثنين من ميكرولتر من 10 ملليمولار dATP، وخمسة ميكرولترات من T4 بوليمرات الحمض النووي، وسبعة ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لاحتضان لمدة 30 دقيقة في 20 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، أضف خمسة ميكرولترات من 10 ملليمولار dNTPs ، وأربعة ميكرولترات من حاجز الربط 10X ، وخمسة ميكرولترات من T4 polynucleotide kinase ، وميكرويلتر واحد من بوليمرات الحمض النووي جزء كبير واحد ، و 25 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى الأنابيب لاحتضان ثاني لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية. لتحديد شظايا معظمها في نطاق حجم الزوج قاعدة 250-550، أداء مرحلة صلبة متتالية عكسها واختيار حجم التعبئة مع 0.6X، ثم 0.9X وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وeeute الحمض النووي مع 100 ميكرولتر من EDTA تريس منخفضة. لسحب البيوتين لكل مكتبة، اغسل 150 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المرتبط بستريبتافيدين مرتين مع 400 ميكرولتر من العازلة توين 1X وتدوير العينات لمدة ثلاث دقائق على عجلة دوارة.
في نهاية الحضانة ، وإعادة إنفاق الخرز في 300 ميكرولتر من 2X لا توين العازلة ومزيج مع 300 ميكرولتر من المواد مرحبا جيم لدوران لمدة 30 دقيقة على عجلة دوارة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخرز ب 400 ميكرولتر من 0.5X Tween العازلة لاحتضان لمدة ثلاث دقائق عند 55 درجة مئوية و 750 ثورة في الدقيقة ، تليها غسلتان في 200 ميكرولتر من حاجز تقييد 1X لكل غسلة. بعد الغسيل الثاني ، أعيد إنفاق الخرز في 100 ميكرولتر من مزيج مخلفات dATP لاحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، وإعادة إنفاق الخرز في 50 ميكرولتر من العازلة ربط 1X ونقل التعليق إلى أنبوب جديد يحتوي على أربعة microliters قبل مهايئات نهاية متجاورة واثنين من microliters من ليغاني T4. بعد ساعتين في درجة حرارة الغرفة، وإزالة supernatant وغسل الخرز مرتين مع 400 ميكرولتر من العازلة توين، ثم غسل الخرز مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من أي العازلة توين ومرة واحدة مع 100 ميكرولتر من العازلة تقييد قبل إعادة تعليق الخرز في 40 ميكرولتر من العازلة تقييد 1X. يتم ملاحظة مسحة من 200 إلى 1000 زوج أساسي عند نجاح التقييد مع Mbo1.
إذا نجح الربط ، لوحظ وجود نطاق عالي الوزن الجزيئي في الجزء العلوي من الجل. ويمكن أيضا تأكيد كفاءة الهضم من خلال PCR الكمية. كفاءة الهضم المقبولة هي 80٪ أو أعلى.
كما هو موضح، يمكن تقدير تضخيم تفاعل متوسط المدى معروف في منتجات ربط Hi-C عن طريق هضم منتج PCR المسترد في التضخيم. يوصى بكفاءة هضم أكثر من 70٪ لتجنب وجود نسبة كبيرة من القراءات غير المفيدة للمكتبات بعد التسلسل. يجب أن يكون عدد دورات PCR للتضخيم النهائي دورة واحدة أقل من عدد الدورات التي تكون اللطاخة مرئية لها.
يشير مستوى هضم المكتبة إلى وفرة أزواج Hi-C الصالحة ويعكس نسبة القراءات المفيدة التي سيتم الحصول عليها من المكتبة. باستخدام أزواج Hi-C الصالحة الفريدة، يمكن إجراء التحليل الأساسي لتوزيع الزوج. كما لوحظ في هذا المثال التمثيلي ، يمكن رؤية الموضع الجيني NOTCH جنبا إلى جنب مع البروتينات المعمارية ، والنطاقين الأول والاثنين ، وتعديلات الهستون على طول الموضع.
عند حذف المنطقة التي تحتوي على كل من موقعي ربط الحمض النووي CTCF و M1BP ، يمكن ملاحظة تغيير كبير في اتصالات الكروماتين. بعد تجربة Hi-C، يمكن إجراء عملية للوصول إلى مجموعة محددة من جهات الاتصال، على سبيل المثال، من مناطق المروج. وهذا مفيد بشكل خاص عند تقييم الجينوم الكبير.
وكما هو موضح، يمكن استخدام الجمع بين بروتوكول Hi-C والإضافة الجينية لتقييم الوظيفة الهيكلية والتنظيمية للعناصر الجينومية.
