يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالتعبير الجيني الذي يبين لنا بالضبط كيف يؤثر هيكل الكروماتين على التعبير الجيني وكيف تنظم منظمة الكروماتين ديناميات النسخ. لقد طورنا هذه التكنولوجيا لأننا أردنا أن نكون قادرين على تغيير العمارة الكروموسومية بشكل مسيطر لتمكين إنشاء حلقات الكروماتين طويلة المدى. بينما في الوقت نفسه لديها القدرة على عكس سياق الكروماتين لاستعادة بنية الكروموسومات الذاتية.
وقد صممت هذه الطريقة لسهولة الاستخدام وقابلية للتطبيق على نطاق واسع. لقد استفدنا من المُكَمّم غير السام، وكذلك الأنواع المتعامدة من dcas9 من أجل السماح باستخدام النظام على نطاق أوسع. لقد طورنا هذه الطريقة لأننا أردنا أن نكون قادرين على الإجابة على سؤال الدجاج والبيض القديم حول ما إذا كان التعبير الجيني يولد بنية الكروموسومات أو ما إذا كان هيكل الكروموسوم يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني.
يتم وصف تصميم تسلسلات RNA دليل CRISPR وصيانة ثقافات الخلايا في بروتوكول النص. يتم سرد خرائط بلاسميد واوافتاء المستخدمة هناك في. ابدأ إعداد البلازميد عن طريق خلط خمسة ميكروغرام من الـ LENTiviral CRISPR plasmid مع ثلاثة ميكرولترات من BsmB1 ثلاثة ميكرولترات من فوسفاتاز القلوية ستة ميكرولترات من 10x عازل الهضم و 0.6 ميكرولترات من 100 ملليمولار أعدت حديثا من DTT.
جلب حجم إجمالي إلى 60 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة واحتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم وفك الفوسفورة البلازميد. ثم، هلام تنقية البلازميد هضم في حلقة plasmid ومزدوجة الماء المقطر. المقبل، وإعداد ردود الفعل التلين لأزواج RNA دليل.
الجمع بين ميكرولتر واحد من كل رنا دليل في 100 micromolar مع ميكرولتر واحد من 10x T4 الربط العازلة 6.5 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة و 0.5 ميكرولترات من T4 PNK لحجم رد فعل إجمالي من 10 ميكرولترات. لجليل أزواج RNA دليل إلى تسلسلات هدفهم احتضان الخلائط في 37 درجة مئوية في 30 دقيقة تليها حضانة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم خفض درجة الحرارة تدريجيا إلى 25 درجة مئوية عن طريق خفضها بمقدار خمس درجات مئوية في الدقيقة. المقبل، وتمييع RNAs دليل محن في 1-200 في الماء المقطر مزدوجة.
الآن، إعداد اثنين من ردود الفعل الربط. مزيج واحد microliter من plasmid هضم مع 0.5 ميكرولترات من دليل perivaneal المخفف RNAse 2.5 microliters من 2x ربط العازلة واحد ميكرولتر من الماء المقطر مزدوجة و 0.5 ميكرولترات من ربط. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لligate أدلة BsmB1 هضم plasmid.
ثم تحويل البلازميد ربط حديثا إلى ثلاثة بكتيريا مستقرة وتضخيم البكتيريا باستخدام أي طريقة إعداد البلازميد. على لوحة ستة بئر، في بئر، البذور 750، 000 2n3 Tcells في DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بكتيريا القلم. استخدام بئر واحد لكل بناء واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي، تغيير المتوسطة إلى المضادات الحيوية الطازجة الحرة DMEM مع 10٪ FBS. الحق بعد تغيير المتوسطة لكل بئر من الخلايا مطلي إعداد أنبوب من خليط إنتاج فيروس العدين. في كل رد فعل، تمييع 11 ميكرولترات من كاشف نقل الدهون قاعدة مع 150 ميكرولترات من المتوسط أوبتي-MEM لكل رد فعل.
ثم في أنابيب منفصلة إعداد الحمض النووي. الجمع بين اثنين من ميكروغرام من ناقلات CLOud9 العدسي بلاسميد مع اثنين من ميكروغرام من مكونات التعبئة والتغليف الزفيرة الأخرى. تخفيف هذا الخليط في 150 ميكرولترات من المتوسط أوبتي-MEM.
ثم الجمع بين وحدات التخزين على قدم المساواة من خليط بلسميد lentiviral المخفف في مُكشف transfection المخفف القائم على الدهون واحتضان المخاليط لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم إلى كل بئر من الخلايا إضافة أنبوب واحد من المخاليط المعدة ومواصلة الحضانة. بعد 48 ساعة، نقل وسائل الإعلام الإنتاج الفيروسية من آبار لوحة إلى مخروطية وتدور عليها في 300 غرام لمدة خمس دقائق.
ثم نقل المناطر إلى أنابيب جديدة للتخلص من الحطام بيليه. الآن ، على الفور استخدام وسائل الإعلام الإنتاج الفيروسية لtransduce الخلايا المستهدفة أو تجميدها في 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. تبدأ بإضافة 250 ميكرولتررس من كل بناء الفيروسية من الفائدة، والتي في هذه الحالة، ويتألف من cloud9 البلازميدات التكميلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على 80،000 الخلايا.
ثم إضافة ما يكفي من بوليبرين بحيث يكون بين واحد وثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر في الحل. ثم ضبط حجم إجمالي في كل أنبوب إلى ملليلتر واحد باستخدام وسائل الإعلام خالية من المضادات الحيوية. الآن لزيادة الاتصال بين جزيئات الفيروس والخلايا تدور الخلايا في 800 غرام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم إعادة تعليق الخلايا في افراون عن طريق الأنابيب. بعد ذلك، قم بتحميل cells'suspension على لوحات الثقافة واحتضانها لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، وجمع الخلايا.
أجهزة الطرد المركزي لهم في 300 غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإعادة تعليقها في الوسط العادي. في اليوم التالي، إضافة البوروميسين وهيغروميسين إلى المتوسطة لتحديد للخلايا المستحثة بشكل مضاعف. وينبغي تحديد التركيز المناسب من المضادات الحيوية مقدما لكل نوع من الخلايا.
ثم، احتضان الخلايا في وسائط التحديد لمدة ثلاثة أيام على الأقل قبل المتابعة مع التطبيقات المتلقين للمعلومات ومتابعة المحافظة على الخلايا والوسائط الاختيار. لتمدي الخلايا CLOud9 المحددة والمستحثة إضافة واحد عبة ا ب المليمللار إلى طبق الثقافة. بالنسبة لعناصر التحكم، أضف DMSO، ثم حافظ على الخلايا مع ABA أو DMSO طوال مدة التجربة.
لعكس الديميرية، قم بغسل الخلايا بما يكفي من برنامج تلفزيوني لتغطية سطح اللوحة مرتين. بعد ذلك، خلايا الثقافة في وسائل الإعلام الخالية من ABA للحفاظ عليها في حالة غير ازن. الاستخدام المناسب للنظام CLOud9 يحفز الاتصال عكسها من التكامل CSA وCSP CLOud9 يبني من خلال إضافة أو إزالة ABA إلى وسائط ثقافة الخلية.
يتم ترجمة ثوابت CSA و CSP إلى المناطق الجينومية المناسبة باستخدام RNAse دليل CRISPR القياسي. تم استخدام التبّنية المناعية كروماتين تليها PCR الكمية لضمان التوطين الدقيق في استهداف كل مكون CLOud9. بالإضافة إلى ذلك coimmunoprecipation مع وبدون رابطة المحامين الأمريكية التحقق من التمسخ CSA و CSP في وجود ليغاند وكذلك عكس في غياب ليغاند.
بعد تضاؤل ABA، تم قياس المزيد من الاتصال بين بيتا-غلوبين وLCR عن طريق التقاط تأكيد الكروموسوم. ومع ذلك، لم يتم ملاحظة هذا في عناصر التحكم التي تحتوي على CSA فقط أو بناء CSP فقط. خلق التفاعل LCR بيتا-globin لم القضاء تماما على اتصال LCR globin الذاتية.
تمت إضافته فقط إلى جهة الاتصال الأصلية. ولوحظت الزيادة في اتصالات بيتا-globin LCR خلال 72 ساعة من التمليس بغض النظر عن المنطقة الدقيقة داخل LCR المستهدفة أو منطقة الترويج بيتا غلوبين. وأخيراً، تم تأكيد عكس النظام مع القبض على تأكيد الكروموسوم بعد إزالة ABA.
وأدى ذلك إلى التجديد الكامل للتأكيد الداخلي. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لتغيير وسائل الإعلام وإضافة خلايا جديدة كلود9 مُنَقَدِمة كل يوم. لا تنسى أن العمل مع فيروس العدس يمكن أن يكون خطيرا للغاية وينبغي دائما اتخاذ جميع الاحتياطات المستخدمة في BSL 2 عند تنفيذ هذا الإجراء.
