نقل أكسونال أمر حيوي لصحة الخلايا العصبية ومقومات البقاء. يصف بروتوكولنا طريقة أنيقة لمراقبة وتحليل النقل المحوري. ويمكن تكييفها لمختلف نماذج الأمراض العصبية.
يتيح استخدام الغرف ذات الفلورويد الدقيق التحكم الزمني المكاني الدقيق، وهو أمر بالغ الأهمية لدراسة بيولوجيا المحور المحوري. وتورط تشوهات النقل المحوري مع العديد من الأمراض العصبية مثل ALS. منصة microfluidic تمكن من دراسة الآليات الأساسية، فضلا عن اختبار العلاجات لإصلاح عيوب النقل المحوري.
يمكن تكييف منصة غرفة microfluidic بسهولة لتناسب جوانب مختلفة من البحوث المحورية، بما في ذلك نمو محور عصبي وانحطاط من الأنواع الفرعية العصبية المختلفة. هذه الطريقة معقدة وتدرس عادة التدريب العملي على. وسوف يزيد العرض التوضيحي المرئي من إمكانية الوصول إلى هذا الإجراء لأي عالم مهتم بدراسة النقل المحوري.
تبدأ من قبل صب PDMS في القوالب الأولية. استخدام الهواء المضغوط لإزالة أي الأوساخ من منصة رقاقة، والتأكد من أن الرقائق تبدو سلسة وواضحة قبل المضي قدما. بعد ذلك، تعبئة وعاء مع النيتروجين السائل وإعداد حقنة 10 ملليلتر مع إبرة قياس 23.
في غطاء الدخان الكيميائي، ضع الرقاقة التي تحتوي على لوحة في حاوية قابلة للغلق، وملء الحقنة بمليلترين من النيتروجين السائل لكل رقاقة تحتوي على لوحة. افتح زجاجة كلوروتري ميثيلسيلين. يخترق الغطاء المطاطي مع الحقنة وحقن النيتروجين في الزجاجة.
دون سحب الإبرة، بدوره زجاجة رأسا على عقب والعيب مليلتر اثنين من الكلوروتريthylsilane لكل رقاقة تحتوي على لوحة. انتشار الكلوروتري ميثيلسيلين في الحاوية، ولكن ليس مباشرة على رقاقة تحتوي على لوحة. أغلق الحاوية.
واحتضانه لمدة خمس دقائق لكل رقاقة. المقبل وزن 47.05 غراما من قاعدة PDMS في أنبوب 50 ملليلتر، وإضافة عامل علاج PDMS بنسبة 16 إلى 1 قاعدة وكيل علاج لمجموع 50 غراما. اخلطي جهاز الـ PDMS لمدة 10 دقائق على دوار سرعة منخفضة، ثم اسكبه في كل رقاقة تحتوي على لوحة إلى الارتفاع المطلوب.
ضع اللوحات داخل جهاز افراغ لمدة ساعتين. التي سوف إزالة الهواء المحاصرين داخل PDMS، وتشكيل قالب موحد واضح. بعد ذلك احتضان الأطباق في فرن لمدة ثلاث ساعات أو بين عشية وضحاها في 70 درجة مئوية.
لإنشاء غرفة microfluidic أو MFC. قطع وإزالة قوالب PDMS من لوحة مع مشرط، والتأكد من عدم فرض القوالب لأنها هشة. اتبع التعليمات الواردة في المخطوطة النصية لتضرب وتقطع الغرف، حسب الإعداد التجريبي.
بالنسبة لثقافة النخاع الشوكي، لكمة بئرين من سبعة ملليمترات في الجانب القاصي من MFC كبيرة، مع التأكد من أنها سوف تتداخل مع حواف القناة. على الجانب القريب، لكمة واحدة سبعة ملليمتر جيدا في منتصف القناة مع الحد الأدنى من التداخل، بحيث يتم ترك مساحة كافية لاكزات. لكمة اثنين إضافية واحد الثقوب ملليمتر في حواف اثنين من القناة القريبة.
وقطع PDMS إلى غرف واحدة. ثم بدوره MFC التي تواجه صعودا، واستخدام إبرة قياس 20 لنحت في ثلاثة كهوف explant الصغيرة على لكمات سبعة ملليمتر جيدا. لثقافة الخلايا العصبية الحركية المنفصلة ، لكمة أربعة آبار ستة ملليمتر ، في حواف القناتين من MFC صغيرة وقطع PDMS إلى غرف واحدة.
لتعقيم MFC، انتشار 50 سنتيمترا أشرطة شريط لاصق طويلة على مقاعد البدلاء. ثم اضغط على وجهي الغرفة على الشريط واسحبه مرة أخرى. وضع الغرف النظيفة في لوحة جديدة واحتضان لهم في الصف التحليلي، من 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقائق على شاكر المدارية.
تخلص من الإيثانول وجفف الغرف في غطاء لثقافة الأنسجة أو في فرن عند درجة حرارة 70 درجة مئوية. ثم ضع الغرفة في وسط خندق أسفل الزجاج الصف ثقافة الأنسجة، وتطبيق قوة طفيفة على حواف لربط PDMS إلى أسفل الطبق. احتضان الطبق لمدة 10 دقائق في 70 درجة مئوية.
ثم اضغط على الغرف لتعزيز الالتزام. احتضان الطبق تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق، ثم انتقل إلى ترميز MFC. أضف 1.5 نانوغرام لكل ملليلتر من PLO إلى كلا المقصورتين.
التأكد من أن منظمة التحرير الفلسطينية تسير عبر القنوات. بواسطة الأنابيب وسائل الإعلام طلاء مباشرة في مدخل القناة. فحص MFC تحت مجهر الضوء، للتحقق من وجود فقاعات.
إذا كانت فقاعات الهواء تمنع الأخاقيق الصغيرة، ضع MFC في مجففات فراغ لمدة دقيقتين. إزالة الهواء الزائد من قنوات MFC. ثم احتضانه بين عشية وضحاها مع منظمة التحرير الفلسطينية.
استبدل منظمة التحرير الفلسطينية باللامينين وحضن MFC لليلة إضافية. قبل الطلاء، وغسل laminin مع ثقافة المتوسطة. تشريح الماوس الحامل ICR E12.5، وفصل الأجنة من الكيس السلوي.
وضع الجنين في طبق السيليكون HBSS. إزالة الرأس والذيل والوجه على بطنه. قشر بلطف قبالة الجلد السطحي من الأجنة مرة أخرى، وفضح الحبل الشوكي.
افصل الحبل الشوكي عن الجسم من الرأس إلى الذيل، باستخدام ملاقط لطيفة. إزالة السحايا، ثم إزالة قرون الظهر وقطع الحبل الشوكي إلى مقاطع عرضية سميكة ملليمتر واحد. تخلص من كافة الوسيطة من المقصورة القريبة من MFC.
التقط اجمالاً من الحبل الشوكي مع ماصة، في حجم إجمالي قدره أربعة ميكرولترات. وحقنه أقرب ما يمكن إلى الكهف. سحب أي سائل الزائدة من البئر القريب عبر منافذ جانبية.
كرر الخطوة السابقة مرتين أكثر وتأكد من أن explants المضمنة في القناة القريبة. إضافة ببطء 150 ميكرولترات من المتوسط SCEX، إلى البئر القريبة. بعد يوم واحد من الطلاء.
استبدال الوسيط SCEX في المقصورة القريبة وإضافة منسق SCEX المتوسطة إلى مقصورة جزية. الحفاظ على تدرج حجم لا يقل عن 15 ميكرولترات في البئر بين الآبار البعيدة والقريبة. بعد أربعة إلى ستة أيام، يجب أن تعبر المحاور إلى المقصورة البعيدة وتكون جاهزة لتصوير النقل المحوري.
لتسمية الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية، وإعداد SCEX المتوسطة الطازجة مع 100 نانو مولولار الميتوكتر عميق الأحمر FM، و 100 نانومولار LysoTracker الأحمر. وإضافته إلى الغرف الصغيرة احتضانهم لمدة 30 إلى 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ثم يغسل ثلاث مرات مع دافئ SCEX المتوسطة. المضي قدما في التصوير الحي للنقل المحوري. الحصول على 100 مرة الفاصل سلسلة صورة في ثلاث فترات ثانية.
مع ما مجموعه خمس دقائق لكل فيلم. بعد سبعة أيام في غرف microfluidic. الماوس الجنينية HB9 GFP الحبل الشوكي explants.
نحن ملطخون بأصباغ MitoTracker العميقة الحمراء و LysoTracker الحمراء. لتسمية الميتوكوندريا والمقصورات الحمضية. تم تصوير أجهزة أكسون في الأخانق البعيدة واستخدم تحليل كيموغراف لتحديد التوزيع العام للحركة.
وكشف هذا التحيز في الاتجاه الرجعي فقط في مقصورات المدينة الحمضية، ولكن ليس في النقل الميتوكوندريا. كما تم تحديد كمية كثافة الجسيمات، مما يكشف عن وجود عدد أكبر من جزيئات الميتوكوندريا مقارنة بالقصور الحمضية في محاور عصبية النخاع الشوكي HB9 GFP. وبعد ذلك، أجري تحليل وحيد لنقل الجسيمات باستخدام برامج حاسوبية شبه آلية متبوعة برمز داخلي.
وكشف هذا التحليل أن المكونات الحمضية والميتوكوندريا لها سرعات جسيمات مماثلة. ولكن المقصورات الحمضية فقط تظهر التحيز نحو الحركة الرجعية. يمكن أن يكون عزل الحبل الشوكي الجنيني صعبًا في البداية.
ممارسة هذا الإجراء عدة مرات، مع التأكد من استخدام العمر الجنيني الصحيح وأدوات التشريح المناسبة. استخدام غرف microfluidic يغير الطريقة التي ندرس الأحياء المحورية. انها تسمح لنا لتصور العمليات المحورية المترجمة، والتي نحن مرة واحدة يفترض أن تحدث إلا في جسم الخلية.
