Aksonal taşıma nöronal sağlık ve canlılık için hayati önem taşımaktadır. Protokolümüz aksonal taşımayı izlemek ve analiz etmek için zarif bir yöntem tanımlar. Ve çeşitli nöronal hastalık modelleri için adapte edilebilir.
Mikroakışkan odaların kullanımı aksonal biyoloji eğitimi için çok önemli olan kesin mekansal zamansal kontrol sağlar. Aksonal ulaşım anormallikleri ALS gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıklarile karışır. Mikroakışkan platform, aksonal taşıma kusurlarını onarmak için temel mekanizmaların incelenmesini ve terapilerin test edilmesini sağlar.
Mikroakışkan oda platformu aksonal araştırmanın farklı yönlerine uyacak şekilde kolayca uyarlanabilir, aksonal büyüme ve çeşitli nöral alt tiplerin dejenerasyonu da dahil olmak üzere. Bu yöntem karmaşıktır ve genellikle uygulamalı olarak öğretilir. Görsel gösteri aksonal ulaşım eğitimi ile ilgilenen herhangi bir bilim adamı için bu prosedürün erişilebilirliğini artıracaktır.
Birincil kalıplarda PDMS döküm ile başlayın. Gofret platformundaki kirleri gidermek için basınçlı hava yı kullanabilirsiniz, devam etmeden önce gofretlerin pürüzsüz ve net görünmesini sağlar. Daha sonra, sıvı nitrojen ile bir kap doldurun ve 23 gauge iğne ile 10 mililitrelik şırınga hazırlamak.
Kimyasal bir duman başlığında, plaka içeren gofreti sızdırmaz bir kapta yerleştirin ve şırıngayı her gofret için iki mililitre sıvı nitrojen içeren plaka ile doldurun. Klorotrimtilsilane şişesi açın. Kauçuk kapağı şırıngayla delin ve nitrojeni şişeye enjekte edin.
İğneyi çekmeden, şişeyi ters çevirin ve her gofret içeren plaka için iki mililitre klorotrimethylsilane çekin. Klorotrimethylsilane'i kapta yayın, ancak doğrudan içeren kofret üzerinde değil. Kabı kapatın.
Ve gofret başına beş dakika kuluçkaya yat. Sonraki 50 mililitrelik bir tüp PDMS baz 47,05 gram tartmak ve toplam 50 gram kür ajan 16-1 baz oranında PDMS kür ajan ekleyin. DÜŞÜK hızlı bir rotatör üzerinde 10 dakika boyunca PDMS karıştırın, sonra istenilen yüksekliğe plaka içeren her gofret içine dökün.
Plakaları iki saat boyunca vakum lu bir kurutucunun içine yerleştirin. Bu da PDMS'de sıkışıp kalan havayı ortadan kaldıracak ve temiz bir üniforma kalıbı oluşturacak. Daha sonra 70 Santigrat üç saat veya gece boyunca bir fırında plakaları kuluçka.
Mikroakışkan hazne veya MFC oluşturmak için. PDMS kalıplarını neşterle plakadan kesin ve çıkarın, kırılgan oldukları için kalıpları zorlamamaya özen. Deneysel kuruluma bağlı olarak, odaları yumruklamak ve kesmek için metin el yazmasındaki talimatları izleyin.
Omurilik ekstrüzyon kültürü için, büyük bir MFC distal tarafında iki yedi milimetrelik kuyu yumruk, onlar kanal kenarları ile örtüşecek emin olun. Proksimal tarafta, en az çakışma ile kanalın ortasında bir yedi milimetre iyi yumruk, böylece ekspertize için yeterli alan bırakılır. Proksimal kanalın iki kenarına iki ek bir milimetre delik delin.
Ve PDMS'yi tek bölmeye böl. Daha sonra MFC'yi yukarı doğru çevirin ve delikli yedi milimetrelik kuyunun üzerine üç küçük ekstrüzyon mağarasına oymak için 20 kalibrelik bir iğne kullanın. Ayrık motor nöron kültürü için, küçük bir MFC iki kanal kenarlarında dört altı milimetrelik kuyuyumruk ve tek odalar halinde PDMS kesti.
MFC sterilize etmek için, bankta 50 santimetre uzunluğunda yapışkan bantları yayıldı. Sonra kasetteki odanın iki yüzünü de bastırın ve geri çekin. Temiz odaları yeni bir tabağa yerleştirin ve 10 dakika boyunca orbital shaker üzerinde %70 etanol, analitik kalitede kuluçkaya yatırın.
Etanol atın ve bir doku kültür başlık veya 70 santigrat derece bir fırında odaları kuru. Sonra bir doku kültürü sınıf cam alt hendek merkezine oda yerleştirin ve çanak alt PDMS bağlamak için kenarlarında küçük kuvvet uygulayın. 70 santigrat derece 10 dakika boyunca çanak kuluçka.
Sonra bağlılığı güçlendirmek için odalara basın. 10 dakika UV altında çanak kuluçka, sonra MFC kodlama devam edin. Her iki bölmeye de mililitre PLO başına 1,5 nanogram ekleyin.
FKÖ'nün kanallarda olduğundan emin olmak. Kaplama ortamını doğrudan kanal girişine borulayarak. Kabarcıkları kontrol etmek için MFC'yi ışık mikroskobu altında inceleyin.
Hava kabarcıkları mikro olukları engelliyorsa, MFC'yi iki dakika boyunca vakumlu kurutuculara yerleştirin. MFC kanallarından fazla havayı çıkarın. Sonra plo ile bir gecede kuluçka.
FKÖ'yü lamininle değiştirin ve ek bir gece için MFC'yi kuluçkaya yatırın. Kaplamadan önce laminini kültür ortamıyla yıkayın. ICR E12.5 gebe fareyi inceleyin ve embriyoları amniyotik keseden ayırın.
Embriyoyu HBSS Silikon kabına koyun. Başını ve kuyruğunu çıkar ve karnına çevir. Yavaşça geri embriyolar yüzeysel deri soyma, omurilik açığa.
Nazik cımbız kullanarak, kafadan kuymak için vücuttan omurilik ayırın. Menenjler çıkarın, sonra dorsal boynuzları kaldırmak ve bir milimetre kalınlığında enine bölümler halinde omurilik kesti. MFC'nin proksimal bölmesinden tüm ortamları atın.
Dört mikrolitre toplam hacmi, bir pipet ile tek bir omurilik ekstrbitki pick up. Ve mağaraya mümkün olduğunca yakın enjekte edin. Lateral çıkışları ile proksimal kuyudan herhangi bir aşırı sıvı çekin.
Önceki adımı iki kez daha tekrarlayın ve ekskalanların proksimal kanala yerleştirdiğinden emin olun. Yavaşça proksimal kuyuya, SCEX orta 150 mikrolitre ekleyin. Kaplamadan bir gün sonra.
Proksimal bölmedeki SCEX ortamını değiştirin ve distal bölmeye zengin SCEX ortamı ekleyin. Distal ve proksimal kuyular arasında kuyu başına en az 15 mikrolitre hacim degradesi bakımı. Dört ila altı gün sonra, aksondistal bölmeye geçmek ve aksonal taşıma görüntüleme için hazır olmalıdır.
Mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için, 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM ve 100 nanomolar LysoTracker Kırmızı ile taze SCEX orta hazırlamak. Ve mikroakışkan odalara ekleyin. 37 santigrat derecede 30-60 dakika kuluçkaya yat.
Daha sonra sıcak SCEX orta ile üç kez yıkayın. Aksonal taşımanın canlı görüntülemesi ile devam edin. Üç saniye aralıklarla 100 zaman atlamalı görüntü serisi edinme.
Film başına toplam beş dakika. Mikroakışkan odalarda yedi gün kaldıktan sonra. Fare embriyonik HB9 GFP omurilik eksgelentisi.
Biz MitoTracker Deep Red ve LysoTracker Kırmızı boyalar ile lekeli konum. Mitokondri ve asidik bölmeleri etiketlemek için. Distal oluklarda akson lar görüntülenmiş ve genel hareket dağılımını belirlemek için Kymograph analizi kullanılmıştır.
Bu sadece asidik şehir bölmelerinde retrograd yönde bir önyargı ortaya, ama mitokondriyal taşıma değil. Parçacık yoğunluğu da ölçüldü, HB9 GFP omurilik ekstrbitki akson asidik bölmeleri ile karşılaştırıldığında mitokondriyal parçacıkların daha yüksek sayıda ortaya. Daha sonra, tek parçacık taşıma analizi yarı otomatik yazılım ve ardından şirket içi kod kullanılarak yapılmıştır.
Bu analiz, asidik komponentler ve mitokondribenzer parçacık hızlarına sahip olduğunu ortaya koymuştur. Ama sadece asidik bölmeler retrograd harekete karşı bir önyargı gösterir. Embriyonik omuriliği izole etmek ilk başlarda zor olabilir.
Doğru embriyonik yaş ve uygun diseksiyon araçları kullandığınızdan emin olmak, bu prosedürü birkaç kez uygulayın. Mikroakışkan odaların kullanımı aksonal biyoloji çalışma şeklimizi değiştirir. Bir zamanlar sadece hücre vücudunda meydana geldiği varsayımıyla karşımıza çıkan lokalize aksonal süreçleri görselleştirmemizi sağlıyor.
