斧质性运输对神经元健康和生存能力至关重要。我们的协议描述了一种用于监测和分析斧弓传输的优雅方法。并可适用于各种神经元疾病模型。
使用微流体室可实现精确的空间时间控制，这对研究斧头生物学至关重要。斧质传播异常与多种神经退行性疾病（如ALS）有关。微流体平台支持研究基本机制以及测试疗法，以修复斧头传输缺陷。
微流体室平台可以很容易地适应与癌症研究的不同方面，包括各种神经亚型的斧头生长和退化。这种方法很复杂，通常教动手。视觉演示将增加任何有兴趣研究斧弓运输的科学家的可访问性。
首先在主模具中铸造 PDMS。使用加压空气清除晶圆平台上的任何污垢，确保晶圆在继续前看起来光滑和清晰。接下来，将液氮填充容器，用 23 量针准备 10 毫升注射器。
在化学烟气罩中，将含有晶圆的晶圆放在可密封的容器中，并在注射器中填充每个含有板的晶圆两毫升液氮。打开氯三甲基硅烷瓶。用注射器刺穿橡胶盖，将氮气注入瓶子中。
在不拔出针头的情况下，将瓶子倒置，并针对每个含有板的晶圆降低两毫升氯三甲基硅烷。将氯三甲基硅烷分散在容器中，但不得直接在含晶片上。关闭容器。
每片晶圆孵育五分钟。接下来在 50 毫升管中重 47.05 克 PDMS 基座，以 16 比 1 基比加添加 PDMS 固化剂，总重量为 50 克。在低速旋转器上混合 PDMS 10 分钟，然后倒入每个包含板的晶圆中，达到所需的高度。
将板放在真空干燥器内两个小时。这将去除滞留在PDMS内的空气，并形成一个清晰的均匀模具。之后在烤箱中孵育盘子三小时或在70摄氏度下过夜。
创建微流体室或 MFC。用手术刀切割并去除板中的 PDMS 模具，确保不要因为模具易碎而强制模具。按照文本手稿中的说明打孔和切割腔室，具体取决于实验设置。
对于脊髓外植培养，在大型 MFC 的端侧打两个 7 毫米井，确保它们与通道边缘重叠。在近端，在通道中间打一个七毫米井，与最小的重叠，以便有足够的空间留给外植。在近角通道的两个边缘打两个额外的一毫米孔。
将 PDMS 切成单个腔室。然后将 MFC 朝上，用 20 测量针在打孔 7 毫米井上的三个小外层洞穴雕刻。对于分离的运动神经元培养，在小型 MFC 的两个通道的边缘打四个六毫米的孔，将 PDMS 切割成单个腔室。
要对 MFC 进行消毒，请将 50 厘米长的胶带在长长的长磁带上铺在长凳上。然后按胶带上的腔室的两个面，然后将其拉回来。将清洁室放在新板中，并在分析等级中孵育70%乙醇，在轨道摇床上孵育10分钟。
将乙醇处理，并在组织培养罩或70摄氏度的烤箱中干燥室。然后将腔室放在组织培养级玻璃底沟的中心，并在边缘施加轻微力，将 PDMS 与菜底结合。在70摄氏度下孵育10分钟。
然后按压室，加强依从性。在紫外线下孵育碟子10分钟，然后继续编码MFC。每毫升PL二节增加1.5毫微克。
确保巴解组织通过这些渠道运行。直接在通道入口处移液涂层介质。在光学显微镜下检查 MFC，检查气泡。
如果气泡阻塞了微槽，请将 MFC 放在真空干燥器中两分钟。从 MFC 通道中清除多余的空气。然后与巴解组织一夜之间孵育。
用层压代替巴解组织，再孵育 MFC 过夜。电镀前，用培养介质清洗层压素。解剖一只 ICR E12.5 怀孕的小鼠，将胚胎与羊膜囊分离。
将胚胎放入HBSS硅盘中。取下头部和尾巴，翻转到他的肚子上。轻轻地从胚胎上剥下肤浅的皮肤，露出脊髓。
使用柔和的钳子将脊髓从头部分离到头部和尾部。取出脑膜，然后取下后角，将脊髓切成一毫米厚的横向部分。从 MFC 的近侧隔间中处置所有介质。
拿起一个脊髓外植与移液器，在总体积为四微升。并注射它尽可能接近洞穴。通过横向出口从近井中抽出多余的液体。
再重复上一步两次，并确保外植嵌入近向通道中。慢慢添加150微升的SCEX介质，到近井。电镀后一天。
更换近侧隔间中的 SCEX 介质，并将丰富的 SCEX 介质添加到近侧隔间。在近井和近井之间保持每口井至少 15 微升的体积梯度。四到六天后，轴子应穿过到外侧隔间，并准备好进行轴向传输成像。
要标记线粒体和酸性隔间，准备新的SCEX介质与100纳米摩尔米托跟踪深红色调频，和100纳米摩尔LysoTracker红色。并将其添加到微流体室。在37摄氏度下孵育30至60分钟。
然后用温暖的SCEX介质洗三次。继续对斧弓传输进行实时成像。以三秒间隔获取 100 个时间间隔图像系列。
每部电影总共五分钟。在微流体室中七天后。小鼠胚胎HB9 GFP脊髓外植。
我们沾满了米托跟踪器深红色和利索跟踪红色染料。给线粒体和酸性隔间贴上标签。对义沟中的轴孔进行了成像，并采用Kymograph分析来确定一般运动分布。
这揭示了逆行方向的偏差，仅在酸性城市隔间，但不是在线粒体运输。粒子密度也得到量化，与HB9 GFP脊髓外子轴突中的酸性隔间相比，线粒体颗粒数量更高。接下来，使用半自动化软件进行单粒子传输分析，然后使用内部代码进行。
这一分析表明，酸性成分和线粒体具有相似的粒子速度。但是，只有酸性隔间表现出对逆行运动的偏向。隔离胚胎脊髓可能很难在第一。
多次练习这个程序，确保使用正确的胚胎年龄和适当的解剖工具。微流体室的使用改变了我们研究斧头生物学的方式。它允许我们可视化局部的斧神群过程，我们曾经假设这些过程只发生在细胞体中。
