Аксональный транспорт имеет жизненно важное значение для здоровья и жизнеспособности нейронов. Наш протокол описывает элегантный метод мониторинга и анализа аксонального транспорта. И может быть адаптирована для различных моделей нейронных заболеваний.
Использование микрофлюидных камер обеспечивает точный пространственный временный контроль, который имеет решающее значение для изучения аксональной биологии. Аксональные транспортные аномалии связаны с несколькими нейродегенеративными заболеваниями, такими как ALS. Микрофлюидная платформа позволяет изучать основные механизмы, а также тестировать методы лечения для ремонта аксональных транспортных дефектов.
Платформа микрофлюидных камер может быть легко адаптирована в соответствии с различными аспектами аксональных исследований, включая аксональный рост и дегенерацию различных нейронных подтипов. Этот метод является сложным и, как правило, преподается практический. Визуальная демонстрация повысит доступность этой процедуры для любого ученого, заинтересованого в изучении аксонального транспорта.
Начните с литья PDMS в первичных форм. Используйте воздух под давлением, чтобы удалить любую грязь с вафельной платформы, убедившись, что выглядят гладкими и ясными, прежде чем приступить. Затем заполните контейнер жидким азотом и приготовьте 10-миллилитровый шприц с иглой 23 калибра.
В химическом дымовом капюшоне поместите пластину, содержащую пластину, в герметичный контейнер и заполните шприц двумя миллилитров жидкого азота на каждую пластину, содержащую пластину. Откройте бутылку хлоротриметилсилана. Пирс резиновой крышкой со шприцем и ввести азот в бутылку.
Не вытаскивая иглу, переверни бутылку с ног на голову и недостатками двух миллилитров хлоротриметилсилана для каждой пластины, содержащей пластину. Распространение хлоротриметилсилана в контейнере, но не непосредственно на пластине, содержащей пластину. Закройте контейнер.
И инкубировать его в течение пяти минут на. Следующий вес 47,05 граммов базы PDMS в 50 миллилитров трубки, и добавить PDMS лечения агента в соотношении 16 к 1 базы для лечения агента в общей сложности 50 граммов. Смешайте PDMS в течение 10 минут на низкой скорости ротатора, а затем залить его в каждую пластину, содержащую пластину на нужную высоту.
Поместите пластины внутри вакуумного децикатора в течение двух часов. Который будет удалить воздух, захваченных в PDMS, и образуют четкую форму плесени. Затем инкубировать тарелки в духовке в течение трех часов или на ночь при температуре 70 по Цельсию.
Для создания микрофлюидной камеры или МФЦ. Вырезать и удалить ФОРМы PDMS из пластины скальпелем, убедившись, что не заставить формы, потому что они хрупкие. Следуйте инструкциям в текстовой рукописи, чтобы пробить и вырезать камеры, в зависимости от экспериментальной установки.
Для культуры эксплантов спинного мозга пробить две семимиллиметровые скважины в дистальной стороне большого МФЦ, убедившись, что они будут перекрываться с краями канала. На проксимальной стороне, удар один семь миллиметров хорошо в середине канала с минимальным перекрытием, так что достаточно места остается для explants. Удар два дополнительных одного миллиметра отверстия в двух краях проксимального канала.
И разрежьте PDMS на одиночные камеры. Затем поверните MFC лицом вверх, и использовать 20 калибровочных иглы, чтобы вырезать в трех небольших пещерах explant на пробивной семь миллиметров хорошо. Для разобщенной двигательной нейронной культуры пробить четыре шестимиллиметровых колодца по краям двух каналов небольшого МФЦ и разрезать PDMS на одиночные камеры.
Чтобы стерилизовать МФЦ, выложить на скамейку 50-сантиметровые липкие ленточных ленты. Затем нажмите обе стороны камеры на ленту и потяните ее обратно. Поместите чистые камеры в новую тарелку и инкубировать их в аналитическом классе, 70% этанола в течение 10 минут на орбитальном шейкере.
Утилизировать этанол и высушить камеры в капюшоне культуры тканей или в духовке при температуре 70 градусов по Цельсию. Затем поместите камеру в центре ткани культуры класса стекла нижней канаве, и применить незначительные силы по краям, чтобы связать PDMS к блюду дно. Инкубировать блюдо в течение 10 минут при 70 градусах по Цельсию.
Затем нажмите на камеры, чтобы укрепить соблюдение. Инкубировать блюдо под УФ в течение 10 минут, а затем приступить к кодированию МФЦ. Добавьте 1,5 нанограмма на миллилитр ООП в оба отсека.
Убедившись, что ООП работает по каналам. По трубопроводу покрытия средств массовой информации непосредственно в входе в канал. Изучите МФЦ под световым микроскопом, чтобы проверить наличие пузырьков.
Если пузырьки воздуха блокируют микро канавки, поместите МФЦ в вакуумные десицаторы на две минуты. Удалите избыток воздуха из каналов МФЦ. Затем инкубировать его на ночь с ООП.
Замените ООП ламинином и инкубировать МФЦ еще на одну ночь. Перед покрытием, мыть ламинин с культурой среды. Рассекните МЦР E12.5 беременной мыши, и отделить эмбрионы от амниотического мешка.
Положите эмбрион в блюдо HBSS Кремния. Снимите голову и хвост и переверните его на живот. Аккуратно снимите поверхностную кожу с эмбрионов назад, обнажая спинной мозг.
Отделяйте спинной мозг от тела от головы до хвоста, используя нежные пинцеты. Удалите околивания, затем удалите спинные рога и разрежьте спинной мозг на один миллиметр толщиной поперечные секции. Утилизация всей среды из проксимального отсека МФЦ.
Возьмите один спинной мозг explant с пипеткой, в общем объеме четыре микролитров. И ввеснуть его как можно ближе к пещере. Вырисуйте излишки жидкости из проксимальной системы через боковой выход.
Повторите предыдущий шаг еще два раза и убедитесь, что экспланты встроены в проксимальный канал. Медленно добавьте 150 микролитров среды SCEX к проксимальной хорошо. На следующий день после покрытия.
Заменил SCEX среды в проксимальной отсеке и добавить богатые SCEX среды дистального отсека. Поддержание градиента объема не менее 15 микролитров на скважину между дистальными и проксимальными скважинами. Через четыре-шесть дней аксоны должны перейти в дистальный отсек и быть готовыми к аксональной транспортной визуализации.
Для обозначения митохондрий и кислых отсеков приготовьте свежую среду SCEX со 100 наномолярными MitoTracker Deep Red FM и 100 наномоляными LysoTracker Red. И добавьте его в микрофлюидные камеры. Инкубировать их в течение 30 до 60 минут при 37 градусах по Цельсию.
Затем мыть три раза с теплой среде SCEX. Продолжить с живой визуализации аксонального транспорта. Приобретение серии изображений за 100 промежуток времени с интервалом в три секунды.
В общей сложности пять минут на фильм. Через семь дней в микрофлюидных камерах. Мышь эмбриональных HB9 GFP спинного мозга explants.
Мы окрашены с MitoTracker Deep Red и LysoTracker Красные красители. Для обозначения митохондрий и кислых отсеков. Аксоны в дистальных канавках были изображены и анализ Кимографа был использован для определения общего распределения движения.
Это выявило смещение в ретроградном направлении только в кислых городских отсеках, но не в митохондриальном транспорте. Плотность частиц была также количественно, выявление большего числа митохондриальных частиц по сравнению с кислыми отсеками в HB9 GFP спинного мозга explant аксонов. Затем анализ транспортировки отдельных частиц проводился с использованием полуавтоматического программного обеспечения с последующим использованием штатного кода.
Этот анализ показал, что кислые компоненты и митохондрии имеют схожие скорости частиц. Но только кислые отсеки отображают уклон в сторону ретроградного движения. Изолировать эмбриональный спинной мозг может быть трудно на первый взгляд.
Практика этой процедуры несколько раз, убедившись, что использовать правильный эмбриональный возраст и соответствующие инструменты вскрытия. Использование микрофлюидных камер меняет способ изучения аксональной биологии. Это позволяет нам визуализировать локализованные аксональные процессы, которые, как мы когда-то предположили, происходят только в клеточном организме.
