El transporte axonal es vital para la salud neuronal y la viabilidad. Nuestro protocolo describe un método elegante para monitorear y analizar el transporte axonal. Y se puede adaptar para varios modelos de enfermedades neuronales.
El uso de cámaras microfluídicas permite un control temporal espacial preciso, que es crucial para estudiar la biología axonal. Las anomalías del transporte axonal están implicadas con varias enfermedades neurodegenerativas como la ELA. La plataforma microfluídica permite el estudio de mecanismos básicos, así como terapias de prueba para reparar defectos de transporte axonal.
La plataforma de cámara microfluídica se puede adaptar fácilmente para adaptarse a diferentes aspectos de la investigación axonal, incluyendo el crecimiento axonal y la degeneración de varios subtipos neuronales. Este método es complejo y generalmente se enseña práctico. La demostración visual aumentará la accesibilidad de este procedimiento a cualquier científico interesado en estudiar el transporte axonal.
Comience por convertir PDMS en moldes primarios. Utilice aire presurizado para eliminar cualquier suciedad de la plataforma de la oblea, asegurándose de que las obleas se vean suaves y claras antes de continuar. A continuación, llene un recipiente con nitrógeno líquido y prepare una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 23.
En una campana de humo química, coloque la placa que contiene la oblea en un recipiente sellable y llene la jeringa con dos mililitros de nitrógeno líquido por cada placa que contenga la oblea. Abra una botella de clorotrimetilsilano. Perfore la tapa de goma con la jeringa e inyecte el nitrógeno en el frasco.
Sin extraer la aguja, gire la botella al revés e intence dos mililitros de clorotrimetilsilano para cada placa que contenga obleas. Esparce el clorotrimetilsilano en el recipiente, pero no directamente en la placa que contiene la oblea. Cierre el contenedor.
Y incubarlo durante cinco minutos por oblea. A continuación, pese 47,05 gramos de base PDMS en un tubo de 50 mililitros y agregue un agente de curado PDMS en una proporción de 16 a 1 base al agente de curado para un total de 50 gramos. Mezcle el PDMS durante 10 minutos en un rotador de baja velocidad y, a continuación, vierta en cada placa que contenga la oblea a la altura deseada.
Coloque las placas dentro de un desecador de vacío durante dos horas. Que eliminará el aire atrapado dentro del PDMS, y formará un molde uniforme claro. Después incubar las placas en un horno durante tres horas o durante la noche a 70 grados centígrados.
Para crear la cámara microfluídica o MFC. Corte y retire los moldes PDMS de la placa con un bisturí, asegurándose de no forzar los moldes porque son frágiles. Siga las instrucciones del manuscrito de texto para perforar y cortar las cámaras, dependiendo de la configuración experimental.
Para el cultivo de explant de la médula espinal, golpee dos pozos de siete milímetros en el lado distal de un MFC grande, asegurándose de que se superpongan con los bordes del canal. En el lado proximal, perforar un pozo de siete milímetros en el centro del canal con una superposición mínima, de modo que quede suficiente espacio para los explantes. Perforar dos agujeros adicionales de un milímetro en los dos bordes del canal proximal.
Y cortar el PDMS en cámaras individuales. A continuación, gire el MFC mirando hacia arriba, y utilice una aguja de calibre 20 para tallar en tres pequeñas cuevas explantadas en el pozo perforado siete milímetros. Para el cultivo de neuronas motoras disociadas, perforar cuatro pozos de seis milímetros, en los bordes de los dos canales de un pequeño MFC y cortar el PDMS en cámaras individuales.
Para esterilizar el MFC, extienda bandas de cinta adhesiva de 50 centímetros de largo en el banco. A continuación, presione ambas caras de la cámara en la cinta y tire de ella hacia atrás. Coloque las cámaras limpias en una placa nueva e incubarlas en grado analítico, de 70% etanol durante 10 minutos sobre un agitador orbital.
Deseche el etanol y seque las cámaras en una campana de cultivo de tejido o en un horno a 70 grados centígrados. A continuación, coloque la cámara en el centro de una zanja inferior de vidrio de grado de cultivo de tejido y aplique una fuerza menor en los bordes para unir el PDMS al fondo del plato. Incubar el plato durante 10 minutos a 70 grados centígrados.
A continuación, presione sobre las cámaras para fortalecer la adherencia. Incubar el plato bajo UV durante 10 minutos, luego proceder a la codificación del MFC. Añadir 1,5 nanogramos por mililitro OLP a ambos compartimentos.
Asegurarse de que la OLP está corriendo a través de los canales. Pipeteando los medios de recubrimiento directamente en la entrada del canal. Examine el MFC bajo un microscopio de luz, para comprobar si hay burbujas.
Si las burbujas de aire bloquean las micro ranuras, coloque el MFC en un desecador de vacío durante dos minutos. Elimine el exceso de aire de los canales MFC. Luego incubar durante la noche con la OLP.
Reemplace la OLP por laminin e incubar el MFC para una noche adicional. Antes del enchapado, lave la laminina con un medio de cultivo. Diseccionar un ratón embarazada ICR E12.5 y separar los embriones del saco amniótico.
Ponga el embrión en el plato de silicio HBSS. Retire la cabeza y la cola y voltéela sobre su vientre. Pelar suavemente la piel superficial de los embriones hacia atrás, exponiendo la médula espinal.
Separe la médula espinal del cuerpo de la cabeza a la cola, usando pinzas suaves. Retire las meninges, luego retire los cuernos dorsales y corte la médula espinal en secciones transversales de un milímetro de espesor. Deseche todo el medio del compartimento proximal del MFC.
Recoger una sola explant de la médula espinal con una pipeta, en un volumen total de cuatro microlitros. E inyéctalo lo más cerca posible de la cueva. Extraiga cualquier exceso de líquido del pozo proximal a través de las salidas laterales.
Repita el paso anterior dos veces más y asegúrese de que los explants están incrustados en el canal proximal. Añadir lentamente 150 microlitros de medio SCEX, al pozo proximal. Un día después del enchapado.
Se ha sustituido el medio SCEX en el compartimento proximal y se añade un medio SCEX rico al compartimento distal. Mantener un gradiente de volumen de al menos 15 microlitros por pozo entre los pozos distales y proximales. Después de cuatro a seis días, los axones deben cruzar al compartimiento distal y estar listos para la toma de imágenes de transporte axonal.
Para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos, prepare un medio SCEX fresco con 100 nanomolares MitoTracker Deep Red FM y 100 nanomolares LysoTracker Red. Y añádalo a las cámaras microfluídicas. Incubarlos durante 30 a 60 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, lave tres veces con un medio SCEX cálido. Proceder con imágenes en vivo del transporte axonal. Adquirir una serie de imágenes de lapso de tiempo de 100 en tres intervalos.
Con un total de cinco minutos por película. Después de siete días en cámaras microfluídicas. Explanta la médula espinal HB9 GFP embrionaria de ratón.
Estamos manchados con los tintes Rojo Profundo y LysoTracker Rojo. Para etiquetar las mitocondrias y los compartimentos ácidos. Se tomaron imágenes de axones en las ranuras distales y se utilizó el análisis de kymograph para determinar la distribución general del movimiento.
Esto reveló un sesgo en la dirección retrógrada sólo en compartimentos ácidos de la ciudad, pero no en el transporte mitocondrial. La densidad de partículas también se cuantificó, revelando un mayor número de partículas mitocondriales en comparación con los compartimentos ácidos en los ejes explantados de la médula espinal HB9 GFP. A continuación, se llevó a cabo un análisis de transporte de partículas únicas utilizando software semiautomático seguido de código interno.
Este análisis reveló que los componentes ácidos y las mitocondrias tienen velocidades de partículas similares. Pero sólo los compartimentos ácidos muestran un sesgo hacia el movimiento retrógrado. Aislar la médula espinal embrionaria puede ser difícil al principio.
Practique este procedimiento varias veces, asegurándose de utilizar la edad embrionaria correcta y las herramientas de disección adecuadas. El uso de cámaras microfluídicas cambia la forma en que estudiamos la biología axonal. Nos permite visualizar procesos axonales localizados, que una vez nos presume que ocurren sólo en el cuerpo celular.
