תחבורה אקסונאלית חיונית לבריאות וכדאיות עצבית. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה אלגנטית לניטור וניתוח תחבורה אקסונאלית. והוא יכול להיות מותאם עבור מודלים שונים של מחלות עצביות.
השימוש בתאים מיקרופלואידיים מאפשר שליטה זמנית מרחבית מדויקת, החיונית לחקר הביולוגיה האקסונאלית. הפרעות תחבורה אקסונאליות מעורבים עם מספר מחלות ניווניות כגון ALS. הפלטפורמה המיקרופלואידית מאפשרת לימוד מנגנונים בסיסיים, כמו גם בדיקת טיפולים לתיקון פגמים בתחבורה האקסונאלית.
ניתן להתאים בקלות את פלטפורמת התא המיקרופלואידית להיבטים שונים של מחקר אקסונאלי, כולל צמיחה אקסונאלית והתנוונות של תת-סוגים עצביים שונים. שיטה זו מורכבת ובדרך כלל מלמדת מעשית. ההדגמה החזותית תגדיל את הנגישות של הליך זה לכל מדען המעוניין ללמוד תחבורה אקסונאלית.
התחל על ידי יציקת PDMS בתבניות ראשוניות. השתמש באוויר בלחץ כדי להסיר כל לכלוך מפלטפורמת הוופל, לוודא כי הוופלים נראים חלקים וברורים לפני שתמשיך. לאחר מכן, למלא מיכל עם חנקן נוזלי ולהכין מזרק 10 מיליליטר עם מחט 23 מד.
במכסה המנוע של אדים כימיים, מניחים את הוופל המכיל צלחת במיכל אטום, וממלאים את המזרק בשני מיליליטר של חנקן נוזלי לכל רקיק המכיל צלחת. פתח בקבוק כלורוטרימיטילסיליין. לנקב את כובע הגומי עם המזרק ולהזריק את החנקן לתוך הבקבוק.
מבלי לשלוף את המחט, להפוך את הבקבוק במהופך ואת החסרונות שני מיליליטר של chlorotrimethylsilane עבור כל רקיק המכיל צלחת. מורחים את הכלורוטרימתילסילן במיכל, אך לא ישירות על הוופל המכיל צלחת. סגור את הגורם המכיל.
ולהדקר אותו במשך חמש דקות לכל רקיק. הבא לשקול 47.05 גרם של בסיס PDMS בצינור 50 מיליליטר, ולהוסיף סוכן ריפוי PDMS ביחס של 16 ל 1 בסיס לריפוי סוכן עבור סך של 50 גרם. מערבבים את ה- PDMS במשך 10 דקות על מסובב במהירות נמוכה, ואז יוצקים אותו לתוך כל רקיק המכיל צלחת לגובה הרצוי.
מניחים את הצלחות בתוך מעבה ואקום במשך שעתיים. אשר יסיר אוויר לכוד בתוך PDMS, ו ליצור עובש אחיד ברור. לאחר מכן לה הדגירה את הצלחות בתנור במשך שלוש שעות או לילה ב 70 צלזיוס.
כדי ליצור את התא המיקרופלואידי או MFC. חותכים ומסירים את תבניות ה-PDMS מהצלחת עם אזמל, ומוודאים לא לכפות את התבניות כי הן שבריריות. בצע את ההוראות בכתב היד טקסט כדי אגרוף לחתוך את התאים, בהתאם ההתקנה הניסיונית.
לתרבות explant חוט השדרה, אגרוף שתי בארות שבעה מילימטר בצד הדיסטלי של MFC גדול, לוודא שהם יחפפו עם קצוות התעלה. בצד הפרוקסימלי, אגרוף אחד שבעה מילימטר גם באמצע התעלה עם חפיפה מינימלית, כך מספיק מקום נשאר עבור explants. ניקוב שני חורים נוספים מילימטר אחד בשני הקצוות של התעלה הפרוקסימלית.
וחתכו את ה-PDMS לחדרים בודדים. ואז להפוך את MFC פונה כלפי מעלה, ולהשתמש מחט מד 20 כדי לגלף בשלוש מערות explant קטן על אגרוף שבעה מילימטר היטב. לתרבות נוירונים מוטוריים מנותקים, אגרוף ארבע בארות שישה מילימטר, בקצוות של שני הערוצים של MFC קטן לחתוך את PDMS לתאים בודדים.
כדי לעקר את ה-MFC, פזרו על הספסל להקות קלטות דביקות באורך 50 ס"מ. ואז ללחוץ על שני הפנים של התא בקלטת ולמשוך אותו בחזרה. מניחים את התאים הנקיים בצלחת חדשה ו דגירה אותם בכיתה אנליטית, של 70% אתנול במשך 10 דקות על שייקר מסלולית.
יש להשליך את האתנול ולייבש את התאים במכסה המנוע של תרבות הרקמה או בתנור בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מניחים את התא במרכז תעלת זכוכית כיתה תרבות רקמה, ולהחיל כוח קטין על הקצוות כדי לקשור את PDMS לתחתית המנה. דגירה המנה במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן לחץ על התאים כדי לחזק את הדבקות. הדגירה את המנה תחת UV במשך 10 דקות, ולאחר מכן להמשיך קידוד MFC. הוסף 1.5 ננוגרם למיליליטר אש"ף לשני התאים.
לוודא כי אש"ף פועל דרך הערוצים. על ידי צינורות מדיה ציפוי ישירות בכניסה לתעלה. בדוק את MFC תחת מיקרוסקופ אור, כדי לבדוק בועות.
אם בועות אוויר חוסמות את חריצים מיקרו, למקם את MFC ב desiccators ואקום במשך שתי דקות. הסר אוויר עודף מערוצי MFC. ואז לה הדגירה אותו לילה עם אש"ף.
החלף את אש"ף בלמינין ודגירה של ה- MFC ללילה נוסף. לפני הציפוי, לשטוף את למינין עם מדיום תרבות. לנתח עכבר ICR E12.5 בהריון, ולהפריד את העוברים ממקום מי המפיר.
שים את העובר בצלחת סיליקון HBSS. הסר את הראש והזנב והפוך אותו על בטנו. לקלף בעדינות את העור השטחי מן העוברים בחזרה, חושף את חוט השדרה.
הפרד את חוט השדרה מהגוף מהראש לזנב, באמצעות פינצטה עדינה. הסר את קרום המוח, ולאחר מכן להסיר את קרני הגב לחתוך את חוט השדרה לתוך חלקים רוחביים עבים מילימטר אחד. השלך את כל המדיום מהתא הפרוקסימלי של ה- MFC.
להרים explant חוט עמוד השדרה יחיד עם פיפטה, בנפח כולל של ארבעה microliters. ולהזריק אותו קרוב ככל האפשר למערה. משוך החוצה כל נוזל עודף מן הקן הפרוקסימלי דרך שקעים משניים.
חזור על השלב הקודם פעמיים נוספות וודא שההתפוצצות מוטבעת בערוץ הפרוקסימלי. מוסיפים באיטיות 150 מיקרוליטרים של מדיום SCEX, לגם הפרוקסימלי. יום אחד אחרי ציפוי.
החליף את מדיום SCEX בתא הפרוקסימלי והוסיף מדיום SCEX עשיר לתא הדיסטלי. שמירה על שיפוע נפח של לפחות 15 מיקרוליטרים לגם בין בארות דיסטליות ופרוקסימליות. לאחר ארבעה עד שישה ימים, האקסונים צריכים לעבור לתא הדיסטלי ויהיו מוכנים להדמיית הובלה אקסונאלית.
כדי לתייג את המיטוכונדריה ואת התאים החומציים, הכינו מדיום SCEX טרי עם 100 ננומולרים MitoTracker אדום עמוק FM, ו 100 ננומולרים LysoTracker אדום. ולהוסיף אותו לחדרים המיקרופלואידיים. דגירה אותם במשך 30 עד 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם מדיום SCEX חם. המשך עם הדמיה חיה של הובלה אקסונאלית. רכישת סדרת תמונות של 100 פעמים בשלושה מרווחי זמן שניים.
עם סך של חמש דקות לכל סרט. אחרי שבעה ימים בתאים מיקרופלואידיים. עכבר עוברי HB9 GFP חוט השדרה מתפוצץ.
אנחנו מוכתמים בצבעי MitoTracker אדום עמוק וצבעים אדומים של LysoTracker. כדי לתייג את המיטוכונדריה ותאים חומציים. אקסונים בחורצים הדיסטליים דימוי וניתוח Kymograph שימש כדי לקבוע את התפלגות התנועה הכללית.
זה חשף הטיה בכיוון הנסיגה רק בתאי העיר החומציים, אך לא בתחבורה המיטוכונדרית. צפיפות החלקיקים כומתה גם היא, וחשפה מספר גבוה יותר של חלקיקי מיטוכונדריה בהשוואה לתאים חומציים באקסונים של חוט השדרה HB9 GFP. לאחר מכן, ניתוח הובלת חלקיקים יחיד נערך באמצעות תוכנה חצי אוטומטית ואחריה קוד מקומי.
ניתוח זה גילה כי רכיבים חומציים מיטוכונדריה יש מהירות חלקיקים דומים. אבל רק תאים חומציים מציגים הטיה לתנועה מדרדרת. בידוד חוט השדרה העוברי יכול להיות קשה בהתחלה.
תרגל הליך זה מספר פעמים, הקפד להשתמש בגיל העוברי הנכון ובכלי הניתוח המתאימים. השימוש בתאים מיקרופלואידיים משנה את האופן שבו אנו חוקרים ביולוגיה אקסונאלית. זה מאפשר לנו לדמיין תהליכים אקסונאליים מקומיים, אשר אנו משערים פעם להתרחש רק בגוף התא.
