O transporte axonal é vital para a saúde neuronal e a viabilidade. Nosso protocolo descreve um método elegante para monitorar e analisar o transporte axonal. E pode ser adaptado para vários modelos de doenças neuronais.
O uso de câmaras microfluidas permite um controle temporal espacial preciso, que é crucial para estudar biologia axonal. Anormalidades no transporte axonal estão implicadas com várias doenças neurodegenerativas, como a ELA. A plataforma microfluidica permite o estudo de mecanismos básicos, bem como testar terapias para reparar defeitos de transporte axonal.
A plataforma de câmara microfluida pode ser facilmente adaptada para atender a diferentes aspectos da pesquisa axonal, incluindo crescimento axonal e degeneração de vários subtipos neurais. Este método é complexo e geralmente ensinado de forma prática. A demonstração visual aumentará a acessibilidade deste procedimento a qualquer cientista interessado em estudar o transporte axonal.
Comece lançando PDMS em moldes primários. Use ar pressurizado para remover qualquer sujeira da plataforma de wafer, certificando-se de que os wafers pareçam suaves e claros antes de prosseguir. Em seguida, encha um recipiente com nitrogênio líquido e prepare uma seringa de 10 mililitros com uma agulha calibre 23.
Em um capô de fumaça química, coloque o wafer contendo placa em um recipiente vedado, e encha a seringa com dois mililitros de nitrogênio líquido por cada wafer contendo placa. Abra uma garrafa de clorofoitilsilano. Fure a tampa de borracha com a seringa e injete o nitrogênio na garrafa.
Sem puxar a agulha, vire a garrafa de cabeça para baixo e desenhe dois mililitros de clorofomilano para cada wafer contendo placa. Espalhe o clorofosilano no recipiente, mas não diretamente no wafer contendo a placa. Feche o recipiente.
E incubar por cinco minutos por wafer. Em seguida, pese 47,05 gramas de base PDMS em um tubo de 50 mililitros, e adicione agente de cura PDMS a uma proporção de 16 a 1 base ao agente de cura para um total de 50 gramas. Misture o PDMS por 10 minutos em um rotador de baixa velocidade e despeje-o em cada wafer contendo placa à altura desejada.
Coloque as placas dentro de um desiccator a vácuo por duas horas. Que removerá o ar preso dentro do PDMS, e formará um molde uniforme claro. Depois incubar as placas em um forno por três horas ou durante a noite a 70 Celsius.
Para criar a câmara microfluidica ou MFC. Corte e remova os moldes PDMS da placa com um bisturi, certificando-se de não forçar os moldes porque eles são frágeis. Siga as instruções do manuscrito do texto para perfurar e cortar as câmaras, dependendo da configuração experimental.
Para a cultura da explant medular, soque dois poços de sete milímetros no lado distal de um MFC grande, certificando-se de que eles se sobrepõem com as bordas do canal. No lado proximal, soque um poço de sete milímetros bem no meio do canal com sobreposição mínima, de modo que espaço suficiente seja deixado para as explantas. Faça dois furos adicionais de um milímetro nas duas bordas do canal proximal.
E cortar o PDMS em câmaras simples. Em seguida, gire o MFC voltado para cima, e use uma agulha de calibre 20 para esculpir em três pequenas cavernas de explant no poço perfurado de sete milímetros. Para a cultura do neurônio motor dissociado, soque quatro poços de seis milímetros, nas bordas dos dois canais de um pequeno MFC e corte o PDMS em câmaras únicas.
Para esterilizar o MFC, espalhe faixas de fita adesivas de 50 centímetros de comprimento no banco. Em seguida, pressione ambos os rostos da câmara na fita e puxe-a de volta. Coloque as câmaras limpas em uma nova placa e incuba-as em grau analítico, de 70% de etanol por 10 minutos em um agitador orbital.
Descarte o etanol e seque as câmaras em uma capa de cultura de tecido ou em um forno a 70 graus Celsius. Em seguida, coloque a câmara no centro de uma vala de fundo de vidro de grau de cultura tecidual, e aplique uma pequena força nas bordas para ligar o PDMS ao fundo do prato. Incubar o prato por 10 minutos a 70 graus Celsius.
Em seguida, pressione as câmaras para fortalecer a adesão. Incubar o prato sob UV por 10 minutos e, em seguida, proceder à codificação do MFC. Adicione 1,5 nanogramas por MILilitro OLP aos dois compartimentos.
Certificando-se de que a OLP está passando pelos canais. Ao canalizar a mídia de revestimento diretamente na entrada do canal. Examine o MFC sob um microscópio leve, para verificar se há bolhas.
Se as bolhas de ar estiverem bloqueando as micro ranhuras, coloque o MFC em um desiccator a vácuo por dois minutos. Remova o excesso de ar dos canais MFC. Em seguida, incuba-lo durante a noite com a OLP.
Substitua a OLP por laminina e incuba o MFC por mais uma noite. Antes de emplacamento, lave o laminina com meio de cultura. Dissecar um rato grávida ICR E12.5 e separar os embriões do saco amniótico.
Coloque o embrião no prato de silicone HBSS. Retire a cabeça e a cauda e vire-a para a barriga dele. Retire suavemente a pele superficial dos embriões para trás, expondo a medula espinhal.
Separe a medula espinhal do corpo da cabeça à cauda, usando pinças suaves. Remova as meninges, depois remova os chifres dorsais e corte a medula espinhal em seções transversais de um milímetro de espessura. Descarte todos os meios do compartimento proximal do MFC.
Pegue uma única explanta medular com uma pipeta, em um volume total de quatro microliters. E injetá-lo o mais perto possível da caverna. Retire qualquer excesso de líquido do poço proximal através das saídas laterais.
Repita a etapa anterior mais duas vezes e certifique-se de que as explantas estejam incorporadas no canal proximal. Adicione lentamente 150 microliters de meio SCEX, ao poço proximal. Um dia depois do chapeamento.
Substituiu o meio SCEX no compartimento proximal e adicionei o rico meio SCEX ao compartimento distal. Mantendo um gradiente de volume de pelo menos 15 microliters por poço entre os poços distal e proximal. Após quatro a seis dias, os axônios devem atravessar para o compartimento distal e estar prontos para imagens de transporte axonal.
Para rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos, prepare o meio SCEX fresco com 100 nanomolar MitoTracker Deep Red FM e 100 nanomolar LysoTracker Red. E adicione-o às câmaras microfluídicas. Incuba-os por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, lave três vezes com o meio SCEX quente. Prossiga com imagens ao vivo do transporte axonal. Adquirindo uma série de imagens de lapso de tempo de 100 em intervalos de três segundos.
Com um total de cinco minutos por filme. Depois de sete dias em câmaras microfluídicas. Explantes da medula espinhal HB9 GFP embrionárias do rato.
Estamos manchados com corantes MitoTracker Deep Red e LysoTracker Red. Para rotular as mitocôndrias e compartimentos ácidos. Axônios nas ranhuras distal foram imagens e a análise de kymógrafo foi usada para determinar a distribuição geral do movimento.
Isso revelou um viés na direção retrógrada apenas em compartimentos ácidos da cidade, mas não no transporte mitocondrial. A densidade de partículas também foi quantificada, revelando um maior número de partículas mitocondriais em comparação com compartimentos ácidos nos axônios explant da medula espinhal HB9 GFP. Em seguida, a análise de transporte de partículas únicas foi realizada utilizando-se software semi-automatizado seguido de código interno.
Esta análise revelou que componentes ácidos e mitocôndrias têm velocidades de partículas semelhantes. Mas apenas compartimentos ácidos mostram um viés em relação ao movimento retrógrado. Isolar a medula espinhal embrionária pode ser difícil no início.
Pratique este procedimento várias vezes, certificando-se de usar a idade embrionária correta e as ferramentas de dissecção apropriadas. O uso de câmaras microfluidas muda a forma como estudamos a biologia axonal. Permite visualizar processos axonais localizados, que uma vez somos hipóteses de ocorrer apenas no corpo celular.
