Así que cuando estamos evaluando nuevos anti-infecciosos, tenemos que abordar dos cosas. Un lado son las bacterias. Si son biopelículas planctónicas o informadas, el otro lado es la presencia de células huésped, especialmente células huésped epiteliales, que forman barreras biológicas estrechas.
Si se realizan estas barreras, cómo podría ser la respuesta monológica, y con este nuevo modelo, podemos monitorear ambos parámetros al mismo tiempo. Al tratar las infecciones bacterianas, tenemos que darnos cuenta de qué órgano está afectado. Por ejemplo, si es el pulmón, podemos tomar ventaja, y administrar tópicamente el medicamento como un aerosol.
Sin embargo, si queremos tener un modelo para estudiar esto, necesitamos un modelo que también permita la posición de aerosoles que es el caso en nuestro modelo. La otra ventaja es que se basa en células humanas, para que podamos evitar problemas debido a diferencias en animales y especies diferencias. Este sistema podría darle más información sobre el campo de la investigación de infecciones mediante el derramamiento de luz sobre eventos moleculares y celulares durante la interacción de las células anfitrionas y bacterias.
Al intentar este protocolo por primera vez, recuerde comprobar el medio celular en busca de esterilidad y morfología celular y tener cuidado al manejar los soportes permeables. Cultivar células CFBE41 O menos en un matraz T 75 con medio esencial mínimo que contenga 10%FCS, 1%aminoácidos no esenciales y 600 miligramos por litro de glucosa a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Agregue un medio fresco a las células cada dos o tres días.
Después de que las células alcanzaron el 70% de confluencia, lávelas con 10 mililitros de PBS y desprendidas con tres mililitros de trippsina EDTA a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Luego, agregue siete mililitros de MEM fresco y centrifugar las células a 300 veces G durante cuatro minutos. Después de desechar el sobrenadante, a 10 mililitros de MEM, mientras se interrumpen los grumos con pipeteo suave.
Contar las células con un contador de células automatizado o una cámara de hemocitociómetro, luego diluirlas a una concentración de 200.000 células por cada 500 microlitros para la siembra en 12 placas de pozos con soportes permeables. Añadir 500 microlitros de la suspensión celular por pozo al lado apical del soporte permeable. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio fresco al lado lateral basal.
Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante 72 horas. Al tercer día después de la siembra, cree una interfaz de líquido de aire quitando el medio del lado lateral basal primero y luego del lado apical. Añadir 500 microlitros de MEM fresco al lado lateral basal y cambiar el medio cada segundo día hasta que las células formen una monocapa confluente.
Para evaluar las propiedades de barrera epitelial de las células, agregue 500 microlitros de medio celular al lado apical, y 1,5 mililitros al lado lateral basal, luego devolvió la placa a la incubadora durante una hora. Mida la resistencia eléctrica del material de tránsito o TEER con un electrodo de palillo STX2 ann y un medidor epitelial de voltios ohm. Para cultivar células THP1, cultivarlas en el matraz T 75 usando el medio RPMI 1640, complementado con 10%FCS a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.
Divida las células cada segundo día sembrando 2 millones de células por mililitro en un nuevo matraz T75. Para diferenciar las células THP1, centrifugar el contenido del matraz a 300 veces G durante cuatro minutos, deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en medio fresco y poner en un nuevo matraz T75.
Añadir 10 nanogramos por mililitro PMA a las células y devolverlos a la incubadora. Para separar los macrófagos como células, lávelos una vez con PBS a 37 grados celsius, e incubarlos con tres mililitros de solución de desprendimiento celular que contiene 0,5 EDTA milimolares durante 10 minutos a temperatura ambiente. Compruebe si hay desprendimiento celular bajo un microscopio invertido.
Cuando las células se hayan desprendido, agregue siete mililitros de medio fresco y centrifugarlas a 300 veces G durante cuatro minutos. Después de retirar el sobrenadante, resuspender las células del macrófago en tres mililitros de THP1 medio en un tubo cónico de 15 mililitros, contar las células e incubarlas durante un máximo de una hora antes de configurar el co-cultivo. Para establecer un cocultivo de macrófagos epiteliales, retire el medio de la cámara inferior de los monocapas CFBE41 O menos e invierta cuidadosamente el soporte dentro de un plato petri de vidrio estéril, utilice un rascador celular para eliminar las células que crecen a través de los poros de membrana.
Coloque 200.000 macrófagos THP1 en 200 microlitros de RPMI en el lado lateral basal de la plaquita invertida en cada pozo, cierre los platos de Petri e incubarlos durante dos horas. A continuación, vuelva a colocar las plaquitas en las micro placas de 12 pozos y añada 500 microlitros de medio MEM al lado lateral basal de la plaquita permeable. Inocular 15 mililitros de lb suplementados con 300 microgramos por mililitro ampolla con una sola colonia de P aeruginosa, PAO1GFP, incubar las bacterias durante 18 horas a 37 grados Celsius, mientras que agita a 180 RPM.
Después de la incubación, transfiera las bacterias a un tubo cónico de 50 mililitros, y centrífugas a 3.850 veces G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de PBS estéril que se haya precalentado a 37 grados centígrados. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros y ajuste la concentración de bacterias con el medio de cultivo celular a una concentración final de 200.000 unidades formadoras de colonias por mililitro, que corresponde a una multiplicidad de infección de una bacteria por célula epitelial.
Añadir 100 microlitros de suspensión bacteriana al lado apical del soporte permeable e incubar la placa a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono durante una hora para permitir que las bacterias se adhieran a las células, luego retire cuidadosamente el líquido apical con una pipeta para restaurar las condiciones de ALI. Para experimentos con el tratamiento farmacológico, agregue 500 microlitros de una solución de fármaco diluida en medio celular al lado apical. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio celular al lado lateral basal.
Recoger 500 microlitros del medio lateral atípico y basal y agruparlos para evaluar la CFU de bacterias no unidas. Para evaluar la supervivencia de las bacterias unidas o internalizadas, agregue 500 microlitros de agua fría desionizada estéril a cada compartimiento del soporte permeable, e incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. Si evalúa la CFU a partir de muestras congeladas, descongele a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
A continuación, utilice puntas de pipeta para raspar la superficie de la membrana teniendo cuidado de no poner demasiada presión sobre los pozos. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para eliminar todo el contenido adherido. Con la suspensión bacteriana de ambas fracciones, haga una dilución en serie de uno a 10 con interpolación PBS y plato las bacterias en placas de agar lb.
Incubar las placas de agar a 30 grados celsius durante 16 a 72 horas, luego contar las colonias y calcular la CFU. La morfología del coculo resultante de las células epiteliales bronquiales humanas y los macrófagos en el lado apical y lateral de los soportes permeables se muestran aquí. Una medición e inmunosuchación DE TEER más alta para las proteínas de unión ajustada ZO1, demostró integridad de barrera epitelial.
Para modelar una infección bacteriana, P aeruginosa se inoculó en células CFBE41 o menos. Se observaron macrófagos en el lado apical del cocultivo seis horas después de la infección. El TEER bajó a 250 ohmios por centímetro cuadrado, lo que indica una barrera epitelial comprometida, que también fue sugerida por la tinción ZO1.
Aquí se muestra la migración trans de macrófagos a través de los poros de filtro permeables y la absorción de bacterias por las células THP-1 en el lado apical. En los monocultivos THP-1, la migración de macrófagos ya una hora después de la infección. Mientras tanto, la migración se vio después de tres horas después de la infección en el co-cultivo.
Los co-cultivos infectados tratados con tobramicina durante seis o 20 horas fueron explorados con microscopía láser de escaneo confocal. Sin tratamiento, las células epiteliales o los macrófagos murieron después de 20 horas de infección. A pesar de ser visto después de seis horas de tratamiento en las imágenes de microscopía, un ensayo de UFC demostró que la bacteria no proliferaba.
Sin embargo, las bacterias recuperaron su capacidad de proliferación después del tratamiento de 20 horas. También se midieron los TEER de monocultivos y cocultivos. El cocultivo de las células CFBE41 o menos con THP-1 no indujo ningún cambio en la integridad de la barrera epitelial en comparación con el monocultivo.
Tras la infección, el valor TEER bajó. al realizar este procedimiento, es crucial asegurarse de que las células están asentadas correctamente y la membrana del filtro no se interrumpe. Por lo tanto, los pasos de siembra de celdas deben realizarse cuidadosamente.
Además de este protocolo, la nebulización de antibióticos en las inserciones permitiría ver si la supervivencia de las bacterias cambia en comparación con las condiciones sumergidas.
