Bu yüzden yeni anti-enfektifleri değerlendirirken, iki şeye değinmemiz gerekir. Bir tarafı bakteri. Eğer planktonik veya bilgili biyofilmler ise, diğer tarafta konak hücrelerin varlığı, özellikle epitel konak hücreleri, sıkı biyolojik bariyerler oluşturan.
Eğer bu engeller etkilenirse, monoolojik yanıtın nasıl olabileceği ve bu yeni modelle her iki parametreyi de aynı anda izleyebiliriz. Bakteriyel enfeksiyonları tedavi ederken, hangi organın etkilendiğini anlamamız gerekir. Örneğin, eğer akciğer ise, biz yararlanmak, ve topikal bir aerosol olarak ilaç yönetmek.
Ancak, bunu incelemek için bir modele sahip olmak istiyorsak, modelimizde olduğu gibi aerosollerin pozisyonunu da sağlayan bir modele ihtiyacımız vardır. Diğer bir avantajı ise insan hücrelerine dayanması, böylece hayvanlar ve tür farklılıkları nedeniyle sorunları önleyebilmemizdir. Bu sistem, konak hücreleri ve bakterilerin etkileşimi sırasında moleküler ve hücresel olaylara ışık tutarak enfeksiyon araştırmaları alanında daha fazla bilgi verebilir.
Bu protokolü ilk kez denerken, sterilite ve hücre morfolojisi için hücre ortamını kontrol etmeyi ve geçirimsiz destekleri kullanırken dikkatli olmayı unutmayın. %10 FCS, %1 esansiyel olmayan amino asitler ve litre başına 600 miligram içeren minimum esansiyel ortama sahip bir T 75 şişesinde CFBE41 O eksi hücreleri 37 santigrat derecede %5 karbondioksitle geliştirin. Her 2-3 günde bir hücrelere taze ortam ekleyin.
Hücreler %70 birleştiğinde, 10 mililitre PBS ile yıkayın ve 37 santigrat derecede üç mililitre tripsin EDTA ile 15 dakika ayırın. Daha sonra, yedi mililitre taze MEM ekleyin ve hücreleri 4 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. Supernatant attıktan sonra, MEM 10 mililitre, nazik pipetleme ile kümeleri bozarak.
Hücreleri otomatik bir hücre sayacı veya Hemositometre odası ile sayın, sonra geçirimli destekler ile 12 kuyu plakaları tohumlama için 500 mikrolitre başına 200, 000 hücre konsantrasyonu onları seyreltmek. Geçirilebilir desteğin apikal tarafına kuyu başına hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini ekleyin. Sonra bazal lateral tarafına taze orta 1,5 mililitre ekleyin.
Hücreleri 37 derecede ve %5 karbondioksitle 72 saat kuluçkaya yatırın. Tohumlama dan sonra üçüncü gün, bazal lateral tarafında ilk sonra apikal taraftan orta kaldırarak bir hava sıvı arabirimi oluşturun. Bazal lateral tarafa 500 mikrolitre taze MEM ekleyin ve hücreler bir eşzamanlı monolayer oluşturana kadar her iki günde bir orta değiştirin.
Hücrelerin epitel bariyer özelliklerini değerlendirmek için, apikal tarafa hücre orta 500 mikrolitre ekleyin, ve bazal lateral tarafa 1.5 mililitre, sonra bir saat için kuvöz plaka döndü. Ann STX2 çubuk elektrot ve epitel volt ohm metre ile transit malzeme elektrik direnci veya TEER ölçün. THP1 hücreleri yetiştirmek için, RPMI 1640 orta kullanarak T 75 şişesinde büyümek, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit% 10 FCS ile desteklenmektedir.
Yeni bir T75 şişesinde mililitre başına 2 milyon hücre tohumlayarak hücreleri her iki günde bir bölün. THP1 hücrelerini ayırt etmek için, şişenin içeriğini 4 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin, süpernatant'ı atın. Taze ortamda pelet resuspend ve yeni bir T75 şişesi koymak.
Hücrelere mililitre PMA başına 10 nanogram ekleyin ve onları kuvöze geri döndürün. Hücreler gibi makrofajı ayırmak için, 37 santigrat derecede PBS ile bir kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0,5 milimolar EDTA içeren üç mililitre hücre ayırma çözeltisi ile kuluçkaya yatırın. Ters bir mikroskop altında hücre müfrezesi olup yok.
Hücreler ayrıldığında, yedi mililitre taze orta ve santrifüj ekleyin ve dört dakika boyunca 300 kez G onları santrifüj. Supernatant çıkardıktan sonra, 15 mililitrekonik tüp THP1 orta üç mililitre makrofaj hücreleri resuspend, hücreleri saymak, ve ortak kültür kurmadan önce en fazla bir saat için onları kuluçka. Epitel makrofaj co-kültür kurmak için, CFBE41 O eksi monolayers alt odasından orta kaldırmak ve dikkatle steril bir cam Petri çanak içinde destek ters, membran gözenekleri ile büyümüş hücreleri kaldırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
Her kuyuda ters kesici kesici nin bazal lateral tarafına 200, 000 THP1 makrofajyerleştirin, Petri kaplarını kapatın ve iki saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra kesici uçları 12 kuyu mikro plakaya geri yerleştirin ve geçirgen kesici ucun bazal lateral tarafına 500 mikrolitre MEM ortamı ekleyin. P aeruginosa tek bir koloni ile mililitre ampisilin başına 300 mikrogram ile desteklenen lb 15 mililitre aşılamak, PAO1GFP, 18 saat boyunca bakterileri kuluçkaya yatarak 37 santigrat derece, 180 RPM sallayarak iken.
Kuluçkadan sonra bakterileri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 3, 850 kez G'de santrifüjler. Supernatant atın ve 37 santigrat derece önceden ısıtılmış olan steril PBS 10 mililitre ekleyin. Optik yoğunluğu 600 nanometre olarak ölçün ve hücre kültürü ortamı ile bakterilerin konsantrasyonunu mililitre başına 200,000 koloni oluşturan birim, epitel hücre başına bir bakteri enfeksiyonu çokluğu karşılık gelir nihai konsantrasyonu ayarlayın.
Geçirilebilir desteğin apikal tarafına 100 mikrolitre bakteriyel süspansiyon ekleyin ve bakterilerin hücrelere bağlanmasına izin vermek için bir saat boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le plakayı kuluçkaya yatırın, ardından ALI koşullarını geri getirmek için bir pipetle apikal sıvıyı dikkatlice çıkarın. İlaç tedavisi ile deneyler için, apikal tarafına hücre orta seyreltilmiş bir ilaç çözeltisi 500 mikrolitre ekleyin. Sonra bazal lateral tarafına hücre orta 1.5 mililitre ekleyin.
Atipik ve bazal lateral orta 500 mikrolitre toplamak ve bağlı olmayan bakterilerin CFU değerlendirmek için onları havuz. Bağlı veya içselleştirilmiş bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirmek için, geçirilme desteğinin her bölmesine 500 mikrolitre steril deiyonize soğuk su ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Dondurulmuş numunelerden CFU'u değerlendirirken, 37 derecede 10 dakika eritin.
Daha sonra kuyulara çok fazla baskı yapmamaya dikkat ederek membran yüzeyini kazımak için pipet uçlarını kullanın. Tüm yapıştırılanan içeriği kaldırmak için pipet yukarı ve aşağı. Her iki fraksiyonları bakteriyel süspansiyon ile, PBS ara ile bir ila 10 seri seyreltme yapmak ve lb agar plakaları üzerinde bakteri plaka.
Agar plakalarını 30 derecede 16 ila 72 saat kuluçkaya yatırın, sonra kolonileri sayın ve CFU'yu hesaplayın. Geçirgen desteklerin apikal ve fesleğen lateral tarafında insan bronşiyal epitel hücrelerinin ve makrofajların ortaya çıkan eş kültürünün morfolojisi burada gösterilmiştir. Sıkı kavşak proteinleri ZO1 için daha yüksek BIR TEER ölçümü ve immünboyama, epitel bariyer bütünlüğünü kanıtladı.
Bir bakteriyel enfeksiyon modellemek için, P aeruginosa CFBE41 o eksi hücrelere aşılandı. Makrofajlar enfeksiyondan altı saat sonra eş kültürün apikal tarafında gözlendi. TEER santimetre karesi 250 ohm'a düşerek, ZO1 boyamanın da önerdiği bir epitel bariyerinin uzatıldığını gösteriyor.
Permeable filtre gözenekleri ve apikal tarafında THP-1 hücreleri tarafından bakteri alımı ile makrofaj trans göç burada gösterilmiştir. THP-1 monokültürlerinde makrofaj göçü enfeksiyon sonrası bir saat kadar erkendir. Bu arada göç, ortak kültürdeki enfeksiyon dan üç saat sonra görüldü.
Altı veya 20 saat boyunca tobramisin ile tedavi edilen enfekte ko-kültürler konfokal tarama lazer mikroskopisi ile görüntülendi. Tedavi olmadan, ya epitel hücreleri veya makrofajlar enfeksiyon 20 saat sonra öldü. Mikroskopi resimlerinde altı saatlik tedaviden sonra görülmesine rağmen, CFU'nun bir tonu bakterilerin çoğalmadığını göstermiştir.
Yine de, bakteriler 20 saatlik tedaviden sonra çoğalma yeteneklerini geri kazandılar. Monokültürlerin TEER'i ve ortak kültürler de ölçüldü. THP-1 ile CFBE41 o eksi hücrelerin ortak kültürü monokültür ile karşılaştırıldığında epitel bariyer bütünlüğü herhangi bir değişiklik neden olmadı.
Enfeksiyon üzerine TEER değeri düştü. Bu işlemi gerçekleştirirken, hücrelerin düzgün bir şekilde oturduğundan ve filtre zarının bozulmadığından emin olmak çok önemlidir. Bu nedenle hücre tohumlama adımlarını dikkatle yapılmalıdır.
Bu protokole ek olarak, kesici uçlarda antibiyotiklerin nebülizasyonu, bakterilerin sağkalımlarının dalgıç koşullara göre değişip değişmeyeceğini görmek mümkün olacaktır.
