לכן, כאשר אנו מעריכים אנטי-מדביקים חדשניים, עלינו להתייחס לשני דברים. צד אחד הוא החיידקים. אם הם ביופילמים פלנקטוניים או מושכלים, הצד השני הוא נוכחות של תאים מארחים, במיוחד תאים מארחים אפיתל, אשר יוצרים מחסומים ביולוגיים הדוקים.
אם מחסומים אלה יושפעו, איך התגובה המונולוגית עשויה להיות, ועם מודל חדש זה, אנחנו יכולים למעשה לפקח על שני הפרמטרים בו זמנית. כאשר מטפלים בזיהומים חיידקיים, עלינו להבין איזה איבר מושפע. לדוגמה, אם זה הריאה, אנחנו יכולים לנצל, באופן topically לנהל את התרופה כמו תרסיס.
עם זאת, אם אנחנו רוצים שיהיה לנו מודל ללימוד זה, אנחנו צריכים מודל המאפשר גם את המיקום של אירוסולים וזה המקרה במודל שלנו. היתרון השני הוא שהוא מבוסס על תאים אנושיים, כדי שנוכל להימנע מבעיות עקב הבדלים בין בעלי חיים לבין הבדלי מינים. מערכת זו יכולה לתת לך תובנה רבה יותר לתחום מחקר הזיהום על ידי שפיכת אור על אירועים מולקולריים ותאיים במהלך האינטראקציה של תאים מארחים וחיידקים.
בעת ניסיון פרוטוקול זה בפעם הראשונה, זכור לבדוק את מדיום התא עבור סטריליות ומורפולוגיה של התאים ולהיזהר בעת טיפול בתמיך הניתן חדיר. לטפח CFBE41 O מינוס תאים בבקבוק T 75 עם מדיום חיוני מינימלי המכיל 10% FCS, 1% חומצות אמינו לא חיוניות, ו 600 מיליגרם לליטר גלוקוז ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. מוסיפים מדיום טרי לתאים כל יומיים עד שלושה ימים.
לאחר התאים הגיעו 70%confluency, לשטוף אותם עם 10 מיליליטר של PBS להתנתק עם שלושה מיליליטר של טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף שבעה מיליליטר של MEM טרי צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים G במשך ארבע דקות. לאחר השלכת supernatant, ב 10 מיליליטר של MEM, תוך שיבוש הגושים עם צינורות עדינים.
לספור את התאים עם מונה תאים אוטומטי או תא Hemocytometer, ולאחר מכן לדלל אותם לריכוז של 200, 000 תאים לכל 500 microliters עבור זריעה ב 12 צלחות גם עם תמיכות חדירות. הוסף 500 microliters של ההשעיה התא לכל באר לצד apical של התמיכה חדירה. לאחר מכן מוסיפים 1.5 מיליליטר של מדיום טרי לצד הצדדי הבסיסי.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. ביום השלישי לאחר הזריעה, ליצור ממשק נוזלי אוויר על ידי הסרת המדיום מהצד הצדדי הבסיסי הראשון ולאחר מכן מהצד apical. הוסף 500 microliters של MEM טרי לצד הצדדי הבסיסי ולשנות את המדיום כל יום שני עד התאים יוצרים monolayer confluent.
כדי להעריך את תכונות מחסום האפיתל של התאים, להוסיף 500 microliters של תא בינוני לצד apical, ו 1.5 מיליליטר לצד הצדדי הבסיסי, ואז החזיר את הצלחת לאנקובטור במשך שעה. למדוד את חומר המעבר עמידות חשמלית או TEER עם אלקטרודה מקל אכילה אן STX2 ומטר אום וולט אפיתל. כדי לטפח תאי THP1, לגדל אותם בבקבוק T 75 באמצעות RPMI 1640 בינוני, בתוספת 10% FCS ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לפצל את התאים כל יום שני על ידי זריעת 2 מיליון תאים למיליליטר בבקבוק T75 חדש. כדי להבדיל בין תאי ה- THP1, יש להשליך צנטריפוגה על תכולת הבקבוק פי 300 G למשך ארבע דקות, להשליך את העל-טבעי. תכניסו את הכדור במדיום טרי ותכניסו בקבוק T75 חדש.
מוסיפים 10 ננוגרם למיליליטר PMA לתאים ומחזירים אותם לאנקובטור. כדי לנתק את המקרופאג כמו תאים, לשטוף אותם פעם אחת עם PBS ב 37 מעלות צלזיוס, ו דגירה אותם עם שלושה מיליליטר של פתרון ניתוק התא המכיל 0.5 מילימולרית EDTA במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בדוק אם יש ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ הפוך.
כאשר התאים התנתקו, להוסיף שבעה מיליליטר של בינוני טרי צנטריפוגה אותם ב 300 פעמים G במשך ארבע דקות. לאחר הסרת העל-טבעי, יש להתריע מחדש על תאי המקרופאג' בשלושה מיליליטר של מדיום THP1 בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, לספור את התאים ולרמוס אותם למשך שעה לכל היותר לפני הגדרת השיתוף התרבותי. כדי להקים תרבות מקרופאג אפיתל, להסיר את המדיום מן התא התחתון של CFBE41 O מינוס monolayers בזהירות להפוך את התמיכה בתוך צלחת פטרי זכוכית סטרילית, להשתמש מגרד תאים כדי להסיר את התאים מגודלים דרך נקבוביות קרום.
מניחים 200, 000 מקרופאגים THP1 ב 200 microliters של RPMI בצד הצדדי הבסיסי של להוסיף הפוך בכל באר, לסגור את מנות פטרי, לדגר אותם במשך שעתיים. לאחר מכן מניחים את התוספות בחזרה לתוך 12 צלחות מיקרו באר ולהוסיף 500 microliters של מדיום MEM לצד הצדדי הבסיסי של הכנס חדיר. לחסן 15 מיליליטר של ליברות בתוספת 300 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין עם מושבה אחת של P aeruginosa, PAO1GFP, דגירה החיידקים במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, תוך טלטול ב 180 סל"ד.
לאחר הדגירה, מעבירים את החיידקים לצינור חרוט 50 מיליליטר, וצנטריפוגות ב 3, 850 פעמים G במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי והוסיפו 10 מיליליטר של PBS סטרילי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. למדוד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר ולהתאים את הריכוז של חיידקים עם מדיום תרבות התא לריכוז סופי של 200, 000 מושבה להרכיב יחידות למיליליטר, אשר תואם ריבוי של זיהום של חיידק אחד לכל תא אפיתל.
הוסף 100 microliters של השעיה חיידקית לצד apical של תמיכה חדירה דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת כדי לאפשר חיידקים לצרף לתאים, ולאחר מכן להסיר בזהירות נוזל אפי עם פיפטה כדי לשחזר את תנאי ALI. לניסויים עם טיפול תרופתי, להוסיף 500 microliters של פתרון תרופה מדוללת בתא בינוני לצד apical. לאחר מכן להוסיף 1.5 מיליליטר של תא בינוני לצד הצדדי הבסיסי.
לאסוף 500 microliters של המדיום הדו-תכליתי לא טיפוסי ובזלי ולאסוף אותם כדי להעריך CFU של חיידקים שאינם מחוברים. כדי להעריך את הישרדותם של חיידקים מחוברים או פנימיים, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מים קרים סטריליים לכל תא של התמיכה המחלחלת, והדגירה את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אם מעריכים CFU מדגימות קפואות, מפשירים אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר מכן השתמש טיפים פיפטה כדי לגרד את משטח הממברנה דואג לא לשים יותר מדי לחץ על בארות. פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר את כל התוכן שדבק. עם ההשעיה החיידקית משני השברים, לעשות דילול סדרתי אחד עד 10 עם Tween PBS צלחת החיידקים על צלחות אגר lb.
להדגירה את צלחות אגר ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 72 שעות, ואז לספור את המושבות ולחשב CFU. המורפולוגיה של התרבות השיתוף וכתוצאה מכך של תאים אפיתל הסנפה האנושי מקרופאגים בצד הצדדי אפי ובזיליקום של תמיכות חדירות מוצגים כאן. מדידת TEER גבוהה יותר והגנה על חלבוני הצומת ההדוקים ZO1, הוכיחו שלמות מחסום אפיתל.
כדי מודל זיהום חיידקי, P aeruginosa היה מחוסן על CFBE41 o מינוס תאים. מקרופאגים נצפו בצד האפי של התרבות ה-6 שעות לאחר ההדבקה. TEER ירד ל 250 אוהם סנטימטר בריבוע, המציין מחסום אפיתל בסכנה, אשר הוצע גם על ידי כתמי ZO1.
נדידת טרנס מקרופאג דרך נקבוביות מסנן חדיר ספיגת חיידקים על ידי תאי THP-1 בצד apical מוצג כאן. במונוקולטורות THP-1, נדידת מקרופאג' כבר שעה לאחר ההדבקה. בינתיים ההגירה נראתה לאחר שלוש שעות לאחר ההדבקה בתרבות השיתוף.
תרבויות שיתוף נגועות שטופלו בצברמיצין במשך שש או 20 שעות דימויו עם מיקרוסקופ לייזר סריקה קונפוקל. ללא טיפול, תאי ההתגלות או המקרופאגים מתו לאחר 20 שעות של זיהום. למרות שנראה לאחר שש שעות של טיפול בתמונות מיקרוסקופיה, בדיקה CFU הוכיחה כי החיידקים לא להתרבות.
עם זאת, החיידקים התאוששו יכולת ההתפשטות שלהם לאחר הטיפול 20 שעות. כמו כן נמדדו TEER של מונוקולטורות ותרבויות שיתוף. התרבות השיתוף של CFBE41 o מינוס תאים עם THP-1 לא לגרום לשינויים בשלמות מחסום האפיתל בהשוואה למונוקולטורה.
לאחר ההדבקה, ערך TEER ירד. בעת ביצוע הליך זה, חיוני לוודא כי התאים יושבים כראוי ואת קרום המסנן לא שיבש. לכן שלבי זריעת התא צריכים להתבצע בזהירות.
בנוסף לפרוטוקול זה, ערפיליות של אנטיביוטיקה על תוספות יאפשר לראות אם שינויים הישרדות חיידקים לעומת תנאים שקועים.
