Então, quando estamos avaliando novos anti-infecciosos, temos que abordar duas coisas. Um lado é a bactéria. Se são biofilmes planctônicos ou informados, o outro lado é a presença de células hospedeiras, especialmente células hospedeiras epiteliais, que formam barreiras biológicas apertadas.
Se essas barreiras forem efetuadas, como a resposta monológica pode ser, e com este novo modelo, podemos realmente monitorar ambos os parâmetros ao mesmo tempo. Ao tratar infecções bacterianas, temos que perceber que órgão é afetado. Por exemplo, se for o pulmão, podemos tirar vantagem, e administrar a droga como aerossol.
No entanto, se queremos ter um modelo para estudar isso, precisamos de um modelo que também permita a posição dos aerossóis que é o caso em nosso modelo. A outra vantagem é que é baseado em células humanas, para que possamos evitar problemas devido às diferenças com animais e espécies. Este sistema poderia dar-lhe mais informações sobre o campo da pesquisa de infecções, lançando luz sobre eventos moleculares e celulares durante a interação de células hospedeiras e bactérias.
Ao tentar este protocolo pela primeira vez, lembre-se de verificar o meio celular para esterilidade e morfologia celular e ter cuidado ao manusear os suportes permeáveis. Cultivar CFBE41 O menos células em um frasco T 75 com meio essencial mínimo contendo 10% FCS, aminoácidos não essenciais de 1% e 600 miligramas por litro de glicose a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Adicione meio fresco às células a cada dois ou três dias.
Depois que as células atingirem 70% de confluência, lave-as com 10 mililitros de PBS e desista com três mililitros de trippsina EDTA a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione sete mililitros de MEM fresco e centrifugar as células a 300 vezes G por quatro minutos. Depois de descartar o supernascimento, a 10 mililitros de MEM, enquanto interrompa as moitas com tubulação suave.
Conte as células com um contador celular automatizado ou câmara hemocitâmmetro, em seguida, dilui-as a uma concentração de 200.000 células por 500 microliters para semeadura em 12 placas de poço com suportes permeáveis. Adicione 500 microliters da suspensão celular por poço ao lado apical do suporte permeável. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio fresco ao lado lateral basal.
Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. No terceiro dia após a semeadura, crie uma interface líquida de ar removendo o meio do lado lateral basal primeiro e depois do lado apical. Adicione 500 microliters de MEM fresco ao lado lateral basal e mude o meio a cada dois dias até que as células formem uma monocamada confluente.
Para avaliar as propriedades da barreira epitelial das células, adicione 500 microliters de meio celular ao lado apical e 1,5 mililitros ao lado lateral basal, em seguida, devolveu a placa à incubadora por uma hora. Meça a resistência elétrica do material de trânsito ou TEER com eletrodo de pauzinho ann STX2 e um medidor de volts epiteliais. Para cultivar células THP1, plante-as no frasco T 75 usando o meio RPMI 1640, suplementado com 10% FCS a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Divida as células a cada dois dias semeando 2 milhões de células por mililitro em um novo frasco T75. Para diferenciar as células THP1, centrifugar o conteúdo do frasco a 300 vezes G por quatro minutos, descartar o supernasce. Resuspenque a pelota em meio fresco e coloque um novo frasco T75.
Adicione 10 nanogramas por mililitro PMA às células e devolva-os à incubadora. Para desprender o macrófago como células, lave-as uma vez com PBS a 37 graus Celsius, e incuba-as com três mililitros de solução de descolamento celular contendo 0,5 mililitro EDTA por 10 minutos à temperatura ambiente. Verifique se há desprendimento celular sob um microscópio invertido.
Quando as células se separarem, adicione sete mililitros de meio fresco e centrífugue-os a 300 vezes G durante quatro minutos. Depois de remover o supernaspeuta, resuspengue as células macrófagos em três mililitros de meio THP1 em um tubo cônico de 15 mililitros, conte as células e incuba-as por um máximo de uma hora antes de configurar a co-cultura. Para estabelecer uma co-cultura de macrófago epitelial, remova o meio da câmara inferior do CFBE41 O menos monocamadas e inverta cuidadosamente o suporte dentro de uma placa de petri de vidro estéril, use um raspador de células para remover as células sobrelculcidas através dos poros de membrana.
Coloque 200.000 macrófagos THP1 em 200 microliters de RPMI no lado lateral basal da inserção invertida em cada poço, feche as placas de Petri e incuba-as por duas horas. Em seguida, coloque as pastilhas de volta nas 12 micro placas de poço e adicione 500 microliters de meio MEM ao lado lateral basal da inserção permeável. Inoculado 15 mililitros de lb suplementados com 300 microgramas por mililitro ampicillin com uma única colônia de P aeruginosa, PAO1GFP, incubam a bactéria por 18 horas a 37 graus Celsius, enquanto tremem a 180 RPM.
Após a incubação, transfira a bactéria para um tubo cônico de 50 mililitros, e centrífugas a 3.850 vezes G durante cinco minutos. Descarte o supernascer e adicione 10 mililitros de PBS estéreis que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius. Medir a densidade óptica em 600 nanômetros e ajustar a concentração de bactérias com o meio de cultura celular para uma concentração final de 200.000 unidades formadoras de colônias por mililitro, o que corresponde a uma multiplicidade de infecção de uma bactéria por célula epitelial.
Adicione 100 microliters de suspensão bacteriana ao lado apical do suporte permeável e incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora para permitir que as bactérias se conectem às células, depois remova cuidadosamente o líquido apical com uma pipeta para restaurar as condições de ALI. Para experimentos com tratamento medicamentoso, adicione 500 microliters de uma solução medicamentosa diluída em meio celular ao lado apical. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de meio celular ao lado lateral basal.
Colete 500 microlitadores do meio lateral atípico e basal e junte-os para avaliar a UFC de bactérias não ligadas. Para avaliar a sobrevivência de bactérias anexadas ou internalizadas, adicione 500 microliters de água fria deionizada estéril a cada compartimento do suporte permeável e incuba as células por 30 minutos à temperatura ambiente. Se avaliar a UFC a partir de amostras congeladas, descongele-as a 37 graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, use pontas de pipeta para raspar a superfície da membrana tomando cuidado para não colocar muita pressão sobre os poços. Pipeta para cima e para baixo para remover todo o conteúdo aderido. Com a suspensão bacteriana de ambas as frações, faça uma diluição serial de um a 10 com interpolação PBS e emplaque as bactérias em placas de ágar lb.
Incubar as placas de ágar a 30 graus Celsius por 16 a 72 horas, depois conte as colônias e calcule a UFC. A morfologia da co-cultura resultante das células epiteliais brônquicas humanas e macrófagos no lado lateral apical e manjericão dos suportes permeáveis são mostrados aqui. Uma maior medição de TEER e imunostaining para as proteínas de junção apertada ZO1, provaram a integridade da barreira epitelial.
Para modelar uma infecção bacteriana, p aeruginosa foi inoculada em células CFBE41 o menos. Macrófagos foram observados no lado apical da co-cultura seis horas após a infecção. O TEER caiu para 250 ohm por centímetro quadrado, indicando uma barreira epitelial comprometida, que também foi sugerida pela coloração ZO1.
A migração trans do macrófago através dos poros de filtro permeáveis e da absorção de bactérias por células THP-1 no lado apical é mostrada aqui. Nas monoculturas THP-1, migração de macrófagos já em uma hora após a infecção. Enquanto isso, a migração foi vista após três horas após a infecção na co-cultura.
Co-culturas infectadas tratadas com tobramicina por seis ou 20 horas foram imagens com microscopia a laser de varredura confocal. Sem tratamento, as células epiteliais ou os macrófagos morreram após 20 horas de infecção. Apesar de ter sido visto após seis horas de tratamento nas imagens de microscopia, um ensaio da UFC demonstrou que a bactéria não se proliferava.
No entanto, as bactérias recuperaram sua capacidade de proliferação após o tratamento de 20 horas. O TEER de monoculturas e co culturas também foram medidos. A co-cultura de CÉLULAS CFBE41 o menos com THP-1 não induziu nenhuma alteração na integridade da barreira epitelial em comparação com a monocultura.
Após a infecção, o valor do TEER caiu. Ao realizar este procedimento, é crucial garantir que as células estejam sentadas corretamente e que a membrana do filtro não seja interrompida. Portanto, as etapas de semeadura celular precisam ser realizadas com cuidado.
Além desse protocolo, a nebulização de antibióticos nas pastilhas permitiria ver se a sobrevivência das bactérias muda em comparação com as condições submersas.
