그래서 우리는 새로운 항 감염제를 평가할 때 두 가지를 해결해야 합니다. 한쪽은 박테리아입니다. 그들은 판자 또는 통보 된 생물 막 인 경우, 다른 쪽은 호스트 세포의 존재, 특히 상피 숙주 세포, 꽉 생물학적 장벽을 형성.
이러한 장벽이 적용되면, 어떻게 생물학적 반응이 이루어질 수 있는지, 그리고 이 새로운 모델을 사용하면 실제로 두 매개 변수를 동시에 모니터링할 수 있습니다. 세균성 감염을 취급할 때, 우리는 어떤 기관이 영향을 받는지 깨워야 합니다. 예를 들어, 폐인 경우, 우리는 이점을 활용할 수 있으며, 에어로졸로 약물을 토폴로 투여할 수 있습니다.
그러나, 우리는이 연구를위한 모델을 갖고 싶은 경우에, 우리는 또한 우리의 모델의 경우 에어로졸의 위치를 허용하는 모델이 필요합니다. 또 다른 장점은 인간 세포를 기반으로 하여 동물과 종의 차이로 인한 문제를 피할 수 있다는 것입니다. 이 시스템은 숙주 세포와 박테리아의 상호 작용 도중 분자 및 세포 사건에 빛을 흘리기 위하여 감염 연구의 필드에 더 많은 통찰력을 줄 수 있었습니다.
이 프로토콜을 처음으로 시도할 때, 세포 배지에서 멸균 및 세포 형태학을 확인하고 투과성 지지대를 처리할 때 주의해야 합니다. 10%FCS, 1%비필수 아미노산, 리터당 600밀리그램의 이산화탄소 5%를 함유한 최소 필수 배지로 CFBE41 O 마이너스 세포를 육성합니다. 2~3일마다 셀에 신선한 배지를 추가합니다.
세포가 70%의 합류에 도달한 후, PBS 10밀리리터로 씻어내고 15분 동안 섭씨 37도에서 트립신 EDTA 3밀리리터로 분리합니다. 그런 다음 7 밀리리터의 신선한 MEM을 추가하고 세포를 300배 G에서 4분 동안 원심분리합니다. 상체를 폐기 한 후, MEM의 10 밀리리터에서 부드러운 파이펫으로 덩어리를 방해합니다.
자동 세포 카운터 또는 혈혈계 챔버를 가진 세포를 계산한 다음 투과성 지지체가있는 12 개의 웰 플레이트에서 파종하기 위해 500 마이크로 리터 당 200, 000 세포의 농도로 희석하십시오. 투과성 지지의 정점에 잘 셀 서스펜션 500마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 1.5 밀리리터의 신선한 배지를 기초 측에 추가합니다.
세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 72시간 동안 배양합니다. 파종 후 셋째 날에는 기저 측에서 배지를 제거한 다음 정액 측에서 공기 액체 인터페이스를 만듭니다. 500 마이크로리터의 신선한 MEM을 기초 측에 추가하고 세포가 컨리치 모노레이어를 형성할 때까지 매2일마다 배지를 변경합니다.
세포의 상피 장벽 특성을 평가하기 위해, 정측에 세포 배지의 500 마이크로리터를 추가하고, 1.5 밀리리터를 기저측에 추가한 다음, 플레이트를 인큐베이터로 1시간 동안 반납하였다. 탄 STX2 젓가락 전극과 상피 볼트 옴 미터로 운송 재료 전기 저항 또는 TEER를 측정합니다. THP1 세포를 재배하려면 RPMI 1640 배지를 사용하여 T 75 플라스크에서 성장하여 섭씨 37도에서 10%FCS와 이산화탄소 5%로 보충합니다.
새로운 T75 플라스크에서 밀리리터당 2백만 개의 세포를 시드하여 매일 세포를 분할합니다. THP1 세포를 분화하기 위해 플라스크의 내용을 300배 G에서 4분간 원심분리하고, 상퍼를 폐기한다. 신선한 매체에 펠릿을 다시 중단하고 새로운 T75 플라스크에 넣습니다.
세포에 밀리리터 PMA 당 10 나노그램을 추가하고 인큐베이터에 반환합니다. 세포와 같은 대식세포를 분리하려면 PBS로 한 번 씻고 실온에서 0.5 밀리머 EDTA를 포함하는 세포 분리 용액 3 밀리리터로 인큐베이션하십시오. 반전된 현미경의 밑에 세포 분리를 확인하십시오.
세포가 분리되면 신선한 중간 크기의 7 밀리리터를 넣고 원심분리기를 4분 동안 300배 G로 추가합니다. 상체를 제거한 후, 15밀리리터 원뿔관에서 THP1 배지의 3밀리리터에서 대식세포 세포를 재보중단하고, 세포를 계산하고, 공동 배양을 설정하기 전에 최대 1시간 동안 배양한다. 상피 대식세포 공동 배양을 확립하기 위해 CFBE41 O 의 하부 챔버에서 배지를 제거하고 멸균 유리 페트리 접시 내부의 지지도를 신중하게 반전시키고, 세포 스크레이퍼를 사용하여 막 모공을 통해 자란 세포를 제거한다.
200, 000 THP1 대식세포는 각 우물에 반전 된 인서트의 기저 측에 RPMI의 200 마이크로 리터에 배치, 페트리 접시를 닫고, 두 시간 동안 배양. 그런 다음 인서트를 12개의 마이크로 플레이트에 다시 넣고 침투성 인서치의 기저 측에 500마이크로리터의 MEM 배지를 추가합니다. 15 밀리리터의 접종을 180 RPM에서 흔들면서 180°C에서 18시간 동안 박테리아를 37도에서 18시간 동안 배양한 페아루기노사(PaO1GFP)의 단일 콜로니콜로 밀리리터 암피실린 당 300 마이크로그램으로 보충하였다.
인큐베이션 후, 50 밀리리터 원원형 튜브로 박테리아를 옮기고, 원심분리기는 5분 동안 3, 850회 G로 옮긴다. 상체를 버리고 섭씨 37도에 예열된 멸균 PBS 10 밀리리터를 추가합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하고 상피 세포 당 하나의 박테리아의 감염의 복합성에 해당하는 밀리리터 당 200, 000 콜로니 형성 단위의 최종 농도로 세포 배양 배지와 박테리아의 농도를 조정합니다.
투과성 지지의 정점에 세균 현탁액 100마이크로리터를 추가하고 박테리아가 세포에 부착할 수 있도록 1시간 동안 37도, 이산화탄소 5%에서 플레이트를 배양한 다음, 파이펫으로 압정 액체를 조심스럽게 제거하여 ALI 조건을 복원합니다. 약물 치료를 위한 실험을 위해 세포 배지에서 희석된 약물 용액 500마이크로리터를 apical 측에 추가합니다. 그런 다음 기저 측에 세포 배지 1.5 밀리리터를 추가합니다.
비정형 및 기저 측량 배지의 500 마이크로리터를 수집하고 비 부착 된 박테리아의 CFU를 평가하기 위해 그들을 풀. 부착 또는 내부화 박테리아의 생존을 평가하기 위해, 투과성 지지의 각 구획에 멸균 제열된 차가운 물의 500 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 세포를 배양한다. 냉동 샘플에서 CFU를 평가하는 경우 섭씨 37도에서 10분 동안 해동하십시오.
그런 다음 파이펫 팁을 사용하여 우물에 너무 많은 압력을 가하지 않도록주의하여 멤브레인 표면을 긁어 냅니다. 파이펫을 위아래로 위로 하여 부착된 모든 콘텐츠를 제거합니다. 두 분획에서 세균 현탁액으로, PBS tween와 1 ~ 10 시리얼 희석을 하고 lb agar 접시에 박테리아를 플레이트.
16~72시간 동안 30도의 한천 판을 배양한 다음 식민지를 계산하고 CFU를 계산합니다. 투과성 지지의 정맥 및 바질 측에 인간 기관지 상피 세포 및 대식세포의 결과 공동 배양의 형태는 여기에 도시된다. 단단한 접합 단백질 ZO1에 대한 더 높은 TEER 측정 및 면역 염색은 상피 장벽 무결성을 입증했습니다.
세균감염을 모델링하기 위해, P aeruginosa는 CFBE41 o 마이너스 세포에 접종하였다. 대식세포는 감염 후 6시간 후 공동배시의 정량면에서 관찰되었다. TEER는 섭미터 곱250ohm로 떨어졌으며, 이는 ZO1 염색에 의해 제안된 손상된 상피 장벽을 나타냅니다.
대식세포 트랜스 이동은 투과성 필터 모공 및 박테리아 통풍구를 통해 APICAL 측에 THP-1 세포에 의해 여기에 도시된다. THP-1 단배기에서는, 대식세포 이주가 감염 후 1시간 부터 이른 시동한다. 한편 이주는 공동 배양에서 3시간 후 감염 후 보였다.
6 또는 20 시간 동안 토브라마이신으로 처리 된 감염된 공동 배양은 공초점 스캐닝 레이저 현미경으로 이미지화되었다. 치료없이 상피 세포 또는 대식세포는 감염 20 시간 후에 사망했습니다. 현미경 사진에서 6 시간의 치료 후 볼 수 있음에도 불구하고 CFU 분석은 박테리아가 증식하지 않았다는 것을 입증했습니다.
그럼에도 불구 하 고, 박테리아는 20 시간 치료 후 그들의 확산 능력을 회복. 단일 문화와 공동 문화의 TEER도 측정되었다. THP-1을 가진 CFBE41 o 마이너스 세포의 공동 배양은 단배문화에 비해 상피 장벽 무결성에 있는 어떤 변경도 유도하지 않았다.
감염 시 TEER 값이 떨어졌습니다. 이 절차를 수행할 때 세포가 제대로 앉아 있고 필터 멤브레인이 중단되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 따라서 셀 시드 단계는 신중하게 수행해야 합니다.
이 프로토콜 이외에, 삽입에 항생제의 분기는 박테리아 생존이 잠수 조건에 비해 변경되는지 확인하는 가능하게 할 것입니다.
