Donc, lorsque nous évaluons de nouveaux anti-infectieux, nous devons aborder deux choses. D’un côté, il y a les bactéries. S’il s’agit de biofilms planctoniques ou informés, l’autre côté est la présence de cellules hôtes, en particulier de cellules hôtes épithéliales, qui forment des barrières biologiques serrées.
Si ces obstacles sont effet, comment la réponse monologique pourrait être, et avec ce nouveau modèle, nous pouvons effectivement surveiller les deux paramètres en même temps. Lors du traitement des infections bactériennes, nous devons réaliser quel organe est affecté. Par exemple, si c’est le poumon, nous pouvons en profiter, et administrer topiquement le médicament comme aérosol.
Toutefois, si nous voulons avoir un modèle pour étudier cela, nous avons besoin d’un modèle qui permet également la position des aérosols, ce qui est le cas dans notre modèle. L’autre avantage est qu’il est basé sur des cellules humaines, afin que nous puissions éviter les problèmes dus aux différences avec les animaux et les espèces. Ce système pourrait vous donner plus de perspicacité dans le domaine de la recherche sur les infections en jetant la lumière sur les événements moléculaires et cellulaires au cours de l’interaction des cellules hôtes et des bactéries.
Lorsque vous essayez ce protocole pour la première fois, n’oubliez pas de vérifier le milieu cellulaire pour la stérilité et la morphologie cellulaire et d’être prudent lors de la manipulation des supports perméables. Cultivez les cellules CFBE41 O moins dans un flacon T 75 avec un milieu essentiel minimum contenant 10 % de SFC, 1 % d’acides aminés non essentiels et 600 milligrammes par litre de glucose à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Ajouter le milieu frais aux cellules tous les deux à trois jours.
Après que les cellules ont atteint 70% de confluence, lavez-les avec 10 millilitres de PBS et détachez-les avec trois millilitres de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, ajouter sept millilitres de MEM frais et centrifuger les cellules à 300 fois G pendant quatre minutes. Après avoir jeté le supernatant, à 10 millilitres de MEM, tout en perturbant les touffes avec pipetting doux.
Comptez les cellules avec un compteur de cellules automatisé ou une chambre d’hémocytomètre, puis diluez-les à une concentration de 200 000 cellules par 500 microlitres pour l’ensemencement dans 12 plaques de puits avec des supports perméables. Ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire par puits au côté apical du support perméable. Ajouter ensuite 1,5 millilitres de milieu frais au côté latéral basal.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Le troisième jour après l’ensemencement, créer une interface liquide d’air en enlevant le milieu du côté latéral basal d’abord puis du côté apical. Ajouter 500 microlitres de MEM frais au côté latéral basal et changer le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules forment un monocouche confluent.
Pour évaluer les propriétés de barrière épithéliale des cellules, ajoutez 500 microlitres de milieu cellulaire au côté apical, et 1,5 millilitres au côté latéral basal, puis retournez la plaque à l’incubateur pendant une heure. Mesurez la résistance électrique des matériaux de transit ou TEER à l’aide d’une électrode à baguette ann STX2 et d’un compteur d’ohm volt épithéliale. Pour cultiver les cellules THP1, cultivez-les dans le flacon T 75 à l’aide du milieu RPMI 1640, complété par 10% de FCS à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Divisez les cellules tous les deux jours en ensemencement de 2 millions de cellules par millilitre dans un nouveau flacon T75. Pour différencier les cellules THP1, centrifuger le contenu du flacon à 300 fois G pendant quatre minutes, jeter le supernatant. Resuspendez la pastille dans un milieu frais et mettez dans un nouveau flacon T75.
Ajouter 10 nanogrammes par millilitre de PMA aux cellules et les retourner à l’incubateur. Pour détacher le macrophage comme des cellules, lavez-les une fois avec PBS à 37 degrés Celsius, et incubez-les avec trois millilitres de solution de détachement cellulaire contenant 0,5 millimolar EDTA pendant 10 minutes à température ambiante. Vérifiez s’il y a un décollement cellulaire au microscope inversé.
Lorsque les cellules se sont détachées, ajouter sept millilitres de milieu frais et les centrifuger à 300 fois G pendant quatre minutes. Après avoir enlevé le supernatant, resuspendez les cellules macrophages en trois millilitres de milieu THP1 dans un tube conique de 15 millilitres, comptez les cellules et incubez-les pendant un maximum d’une heure avant de mettre en place la co-culture. Pour établir une co-culture épithéliale de macrophage, retirez le milieu de la chambre inférieure du CFBE41 O moins les monocouches et inversez soigneusement le support à l’intérieur d’une boîte de Petri en verre stérile, utilisez un grattoir cellulaire pour enlever les cellules envahies par les pores membranaires.
Placez 200 000 macrophages THP1 dans 200 microlitres de RPMI sur le côté latéral basal de l’insert inversé dans chaque puits, fermez les boîtes de Petri et incubez-les pendant deux heures. Ensuite, placez les inserts de nouveau dans les 12 plaques micro puits et ajouter 500 microlitres de milieu MEM sur le côté latéral basal de l’insert perméable. Inoculer 15 millilitres de lb complétés par 300 microgrammes par ampicilline millilitre avec une seule colonie de P aeruginosa, PAO1GFP, incuber la bactérie pendant 18 heures à 37 degrés Celsius, tout en secouant à 180 RPM.
Après l’incubation, transférer les bactéries dans un tube conique de 50 millilitres et les centrifugeuses à 3 850 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et ajoutez 10 millilitres de PBS stérile qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Mesurer la densité optique à 600 nanomètres et ajuster la concentration de bactéries avec le milieu de culture cellulaire à une concentration finale de 200 000 unités de formation de colonies par millilitre, ce qui correspond à une multiplicité d’infection d’une bactérie par cellule épithéliale.
Ajouter 100 microlitres de suspension bactérienne sur le côté apical du support perméable et incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure pour permettre aux bactéries de se fixer aux cellules, puis retirer soigneusement le liquide apical avec une pipette pour restaurer les conditions ALI. Pour des expériences avec le traitement de drogue, ajoutez 500 microlitres d’une solution de drogue diluée dans le milieu cellulaire au côté apical. Ajouter ensuite 1,5 millilitres de milieu cellulaire au côté latéral basal.
Recueillir 500 microlitres du milieu latéral atypique et basal et les mettre en commun pour évaluer le CFU des bactéries non attachées. Pour évaluer la survie des bactéries attachées ou intériorisées, ajoutez 500 microlitres d’eau froide déionisée stérile à chaque compartiment du support perméable et incubez les cellules pendant 30 minutes à température ambiante. Si vous évaluez l’UNIVERSITÉ à partir d’échantillons congelés, décongelez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Ensuite, utilisez des pointes de pipette pour gratter la surface de la membrane en prenant soin de ne pas mettre trop de pression sur les puits. Pipette de haut en bas pour supprimer tout contenu adhéré. Avec la suspension bactérienne des deux fractions, faire une dilution en série d’un à 10 avec l’interpolation PBS et plaquer les bactéries sur les plaques d’agar lb.
Incuber les plaques d’agar à 30 degrés Celsius pendant 16 à 72 heures, puis compter les colonies et calculer cfu. La morphologie de la co-culture résultante des cellules épithéliales bronchiques humaines et des macrophages sur le côté latéral apical et basilic des supports perméables sont montrées ici. Une mesure et une immunostaining teer plus élevées pour les protéines de jonction serrée ZO1, se sont avérées l’intégrité épithéliale de barrière.
Pour modéliser une infection bactérienne, P aeruginosa a été inoculé sur les cellules CFBE41 o moins. Des macrophages ont été observés sur le côté apical de la co-culture six heures après infection. Le TEER est tombé à 250 ohm par centimètre carré, indiquant une barrière épithéliale compromise, qui a également été suggérée par la coloration ZO1.
Macrophage trans migration à travers les pores du filtre perméable et l’absorption des bactéries par les cellules THP-1 sur le côté apical est montré ici. Dans les monocultures THP-1, la migration des macrophages dès une heure après l’infection. Pendant ce temps, la migration a été observée après trois heures après l’infection dans la co-culture.
Les co-cultures infectées traitées avec de la tobramycine pendant six ou vingt heures ont été photographiées par microscopie laser à balayage confoccal. Sans traitement, les cellules épithéliales ou les macrophages sont morts après 20 heures d’infection. En dépit d’être vu après six heures de traitement dans les images de microscopie, un essai de CFU a démontré que les bactéries n’ont pas proliféré.
Néanmoins, les bactéries ont récupéré leur capacité de prolifération après le traitement de 20 heures. TEER des monocultures et des co-cultures ont également été mesurés. La co-culture des cellules CFBE41 o moins avec THP-1 n’a induit aucun changement dans l’intégrité épithéliale de barrière comparée à la monoculture.
Lors de l’infection, la valeur TEER a chuté. lors de l’exécution de cette procédure, il est crucial de s’assurer que les cellules sont bien assises et que la membrane filtrante n’est pas perturbée. Par conséquent, les étapes d’ensemencement cellulaire doivent être effectuées avec soin.
En plus de ce protocole, la nébulisation des antibiotiques sur les inserts permettrait de voir si la survie des bactéries change par rapport aux conditions submersées.
