Поэтому, когда мы оцениваем новые антиинфекции, мы должны рассмотреть две вещи. Одной из сторон являются бактерии. Если они являются планктонными или информированными биопленки, другая сторона является наличие принимающих клеток, особенно эпителиальных клеток-хозяина, которые образуют жесткие биологические барьеры.
Если эти барьеры будут установлены, как может быть монологическая реакция, и с помощью этой новой модели мы сможем контролировать оба параметра одновременно. При лечении бактериальных инфекций, мы должны понимать, какой орган влияет. Например, если это легкое, мы можем воспользоваться, и местно управлять препаратом в качестве аэрозоля.
Однако, если мы хотим иметь модель для изучения этого, нам нужна модель, которая также позволяет положение аэрозолей, что имеет место в нашей модели. Другим преимуществом является то, что он основан на клетках человека, так что мы можем избежать проблем из-за различий с животными и видовых различий. Эта система может дать вам больше понимания области исследований инфекции, проливая свет на молекулярные и клеточные события во время взаимодействия клеток-хозяйных клеток и бактерий.
При попытке этого протокола в первый раз, не забудьте проверить клеточной среды для бесплодия и морфологии клеток и быть осторожным при обработке проницаемых опор. Культивировать CFBE41 O минус клетки в колбе T 75 с минимальной необходимой среде, содержащей 10%FCS, 1%non-essential аминокислоты, и 600 миллиграммов на литр глюкозы при 37 градусах Цельсия с 5%углекислым газом. Добавляйте свежую среду в клетки каждые два-три дня.
После того, как клетки достигли 70% слияния, мыть их с 10 миллилитров PBS и отделить с тремя миллилитров трипсина EDTA при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Затем добавьте семь миллилитров свежего MEM и центрифуга клетки в 300 раз G в течение четырех минут. После отбрасывания супернатанта, на 10 миллилитров MEM, в то время как нарушение сгустки с нежным пипетки.
Подсчитайте клетки с автоматизированным счетчиком клеток или гемоцитометрической камерой, затем разбавьте их до концентрации 200 000 клеток на 500 микролитров для посева в 12 хорошо пластин с проницаемыми опорами. Добавьте 500 микролитров клеточной подвески на колодец в апиабельную сторону проницаемой опоры. Затем добавьте 1,5 миллилитров свежей среды к базальной боковой стороне.
Инкубировать клетки при 37 градусах цельсия и 5%углекислого газа в течение 72 часов. На третий день после посева создайте интерфейс воздушной жидкости, удалив среду с базальной боковой стороны, а затем с апической стороны. Добавьте 500 микролитров свежего MEM в базальную боковую сторону и меняйте среду каждый второй день до тех пор, пока клетки не сформируют стеченный монослой.
Для оценки эпителиальных барьерных свойств клеток добавьте 500 микролитров клеточной среды в апильную сторону и 1,5 миллилитров в базальную боковую сторону, а затем назад вернули пластину в инкубатор на час. Измерьте электрическое сопротивление транзитного материала или TEER с электродом палочки ann STX2 и эпителиальным вольтом ohm метром. Чтобы культивировать клетки THP1, выращивайте их в колбе T 75 с использованием RPMI 1640 среды, дополненной 10%FCS при 37 градусах Цельсия и 5%углекислым газом.
Разделите клетки каждый второй день, посев 2 миллиона клеток на миллилитр в новой колбе T75. Чтобы дифференцировать клетки THP1, центрифуга содержимое колбы в 300 раз G в течение четырех минут, отбросить супернатант. Повторное производство гранул в свежей среде и положить в новую колбу T75.
Добавьте 10 нанограмм на миллилитр PMA в клетки и верните их в инкубатор. Чтобы отделить макрофаг, как клетки, мыть их один раз с PBS при температуре 37 градусов по Цельсию, и инкубировать их с тремя миллилитров клеточного раствора отряда, содержащего 0,5 миллимолярной ЭДТА в течение 10 минут при комнатной температуре. Проверьте отслоение клеток под перевернутым микроскопом.
Когда клетки отсоединились, добавьте семь миллилитров свежей среды и центрифугировать их в 300 раз G в течение четырех минут. После удаления супернатанта, повторно использовать макрофаг клетки в трех миллилитров THP1 среды в 15 миллилитров конической трубки, подсчитать клетки, и инкубировать их в течение максимум одного часа, прежде чем создать со-культуры. Для создания эпителиального макрофага со-культуры, удалить среду из нижней палаты CFBE41 O минус монослой и тщательно инвертировать поддержку внутри стерильного стекла Петри блюдо, использовать клеточный скребок для удаления клеток, заросших через мембранные поры.
Поместите 200 000 макрофагов THP1 в 200 микролитров RPMI на базальной боковой стороне перевернутой вставки в каждом колодец, закройте посуду Петри и инкубировать их в течение двух часов. Затем поместите вставки обратно в 12 хорошо микро пластин и добавить 500 микролитров MEM среды базальной боковой стороне проницаемой вставки. Прививка 15 миллилитров фунта дополняется 300 микрограммов на миллилитр ампициллина с одной колонией P aeruginosa, PAO1GFP, инкубировать бактерии в течение 18 часов при 37 градусов по Цельсию, в то время как тряска при 180 об/мин.
После инкубации перенесите бактерии в 50 миллилитровую коническую трубку и центрифуги при 3 850 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте 10 миллилитров стерильного PBS, который был разогрет до 37 градусов по Цельсию. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометров и отрегулируйте концентрацию бактерий со средой клеточной культуры до конечной концентрации 200 000 единиц колонии, образуя единицы на миллилитр, что соответствует множественности инфекции одной бактерии на эпителиа.
Добавьте 100 микролитров бактериальной суспензии в апиальную сторону проницаемой опоры и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение одного часа, чтобы позволить бактериям прикрепляться к клеткам, а затем тщательно удалить апиальную жидкость с пипеткой для восстановления условий ALI. Для экспериментов с медикаментозным лечением добавьте 500 микролитров лекарственного раствора, разбавленного в клеточной среде, к апической стороне. Затем добавьте 1,5 миллилитров клеточной среды к базальной боковой стороне.
Соберите 500 микролитров атипичной и базальной боковой среды и объединить их для оценки CFU неприсоеченных бактерий. Для оценки выживаемости прикрепленных или интернализированных бактерий добавьте 500 микролитров стерильной деионизированной холодной воды в каждый отсек проницаемой опоры и инкубировать клетки в течение 30 минут при комнатной температуре. При оценке CFU из замороженных образцов, оттаивать их при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Затем используйте пипетки советы, чтобы соскребать мембранной поверхности заботы, чтобы не положить слишком много давления на скважины. Pipette вверх и вниз, чтобы удалить все придерживались содержания. С бактериальной суспензией от обеих фракций, сделать от одного до 10 серийных разбавления с PBS tween и пластины бактерий на пластинах фунт агара.
Инкубировать агар пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 16 до 72 часов, а затем подсчитать колоний и вычислить CFU. Здесь показана морфология результирующей со-культуры человеческих бронхиальных эпителиальных клеток и макрофагов на апиальной и базиальной боковой стороне проницаемых опор. Более высокое измерение TEER и иммуностеинирование для плотных белков соединения ЗО1, доказали эпителиационную барьерную целостность.
Чтобы смоделировать бактериальную инфекцию, P aeruginosa был привит на CFBE41 o минус клетки. Макрофаги наблюдались на апической стороне со-культуры через шесть часов после заражения. TEER упал до 250 охм на сантиметр в квадрате, что указывает на скомпрометированный эпителиальный барьер, который также был предложен окрашивание ЗО1.
Макрофаг транс миграции через проницаемые поры фильтра и бактерий поглощения THP-1 клеток на апической стороне показано здесь. В монокультурах ТХП-1 миграция макрофагов уже через час после заражения. Между тем миграция была увидена после 3 часов столб-инфекции в co-культуре.
Зараженные со-культуры, обработанные тобрамицином в течение шести или 20 часов, были изображены с помощью конфокального сканирования лазерной микроскопии. Без лечения, либо эпителиальных клеток или макрофагов умер после 20 часов инфекции. Несмотря на то, видели после шести часов лечения в микроскопии фотографии, CFU анализ показал, что бактерии не размножаются.
Тем не менее, бактерии восстановили свои возможности распространения после 20-часового лечения. Также были измерены ТЕЭР монокультур и совместно культур. Сокультура CFBE41 o минус клетки с THP-1 не вызывали никаких изменений в эпителиальной барьерной целостности по сравнению с монокультурой.
После заражения стоимость TEER упала. при выполнении этой процедуры, очень важно, чтобы убедиться, что клетки сидят должным образом и фильтр мембраны не нарушается. Поэтому шаги по посеву клеток должны быть выполнены тщательно.
В дополнение к этому протоколу, небулизация антибиотиков на вставки позволит увидеть, если бактерии изменения выживания по сравнению с подводными условиями.
