だから、新しい抗感染薬を評価しているとき、私たちは2つのことに取り組まなければなりません。片側は細菌です。彼らがプランクトニックまたは情報に基づいたバイオフィルムである場合、反対側は、狭い生物学的障壁を形成する宿主細胞、特に上皮宿主細胞の存在である。
これらのバリアが影響を受け、単一応答がどのようになっている可能性があり、この新しいモデルでは、実際に両方のパラメータを同時に監視できます。細菌感染を治療する際には、どのような臓器が影響を受けているかを認識する必要があります。例えば、肺であれば、それを利用し、薬をエアロゾルとして局所的に投与することができます。
しかし、これを研究するためのモデルを持ちたい場合は、モデルに当てはまるエアロゾルの位置も可能にするモデルが必要です。もう一つの利点は、それが人間の細胞に基づいているので、動物や種の違いによる問題を避けることができます。このシステムは、宿主細胞と細菌の相互作用の間に分子および細胞事象に光を当てることによって、感染研究の分野に関するより多くの洞察を与えることができる。
初めてこのプロトコルを試みるとき、細胞媒体の無菌性および細胞形態を確認し、透過性支持体を扱う際には注意してください。10%FCS、1%の非必須アミノ酸、および5%の二酸化炭素で摂氏37度で1リットル当たり600ミリグラムの最低必須培地を含むT 75フラスコでCFBE41 Oマイナス細胞を培養します。2~3日ごとに新鮮な培地を細胞に加えます。
細胞が70%の合流度に達した後、PBSの10ミリリットルでそれらを洗浄し、15分間摂氏37度で3ミリリットルのトリプシンEDTAで取り外します。その後、新鮮なMEMを7ミリリットル加え、Gの300倍の細胞を4分間遠心分離します。上清を捨て、MEMの10ミリリットルで廃棄した後、穏やかなピペットで塊を破壊しながら。
自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターチャンバーで細胞を数え、透過性支持体を備えた12ウェルプレートに播種するために、500マイクロリットルあたり200,000細胞の濃度に希釈します。透過性支持体の補助側にウェルあたり500マイクロリットルの細胞懸濁液を加えます。その後、基底側側に新鮮な培地の1.5ミリリットルを追加します。
細胞を摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間インキュベートします。播種後3日目に、まず底底側側から媒体を取り除き、次に、空気液体界面を、次に、天側から取り出して、空気液体界面を作成します。500マイクロリットルの新鮮なMEMを基底側側に加え、細胞がコンフルエント単層を形成するまで2日ごとに培地を交換します。
細胞の上皮バリア特性を評価するには、500マイクロリットルの細胞培地を補助側に加え、基底側側に1.5ミリリットルを加え、プレートを1時間インキュベーターに戻した。輸送材料電気抵抗またはTEERをアンSTX2箸電極および上皮ボルトオームメーターで測定する。THP1細胞を培養するには、RPMI 1640培地を用いてT75フラスコで増殖させ、摂氏37度で10%FCS、炭酸ガス5%を補給する。
新しいT75フラスコに1ミリリットル当たり200万個の細胞を播種して、2日ごとに細胞を分割します。THP1細胞を分化するために、フラスコの内容物をGの300倍に4分間遠心し、上清を捨てる。新鮮な培地でペレットを再び懸濁し、新しいT75フラスコに入れます。
細胞に1ミリリットルPMAあたり10ナノグラムを加え、インキュベーターに戻します。マクロファージのように細胞を取り外すには、PBSで1回37°Cで洗浄し、室温で10分間0.5ミリモルEDTAを含む3ミリリットルの細胞剥離液でインキュベートします。逆顕微鏡で細胞剥離を確認します。
細胞が剥離したら、新鮮な培地を7ミリリットル加え、Gの300倍に4分間遠心分離します。上清を除去した後、マクロファージ細胞を15ミリリットルの円錐チューブ内のTHP1培地の3ミリリットルで再懸濁し、細胞を数え、同時培養を設定する前に最大1時間インキュベートする。上皮マクロファージの共培養を確立するには、CFBE41 Oから単層を引いた下の部屋から培地を取り除き、滅菌ガラスペトリ皿の中で支持体を慎重に反転させ、細胞スクレーパーを使用して膜細孔を介して生育した細胞を除去する。
各ウェルの逆インサートの基底側側にRPMIの200,000のTHP1マクロファージを置き、ペトリ皿を閉じて2時間インキュベートします。その後、12ウェルマイクロプレートに挿入物を戻し、透過性インサートの基底側側にMEM培地の500マイクロリットルを追加します。P緑素吸塩、PAO1GFPの単一コロニーでミリリットルアンピシリンあたり300マイクログラムを加えたlbの15ミリリットルを接種し、180 RPMで振りながら、摂氏37度で18時間細菌をインキュベートする。
インキュベーション後、細菌を50ミリリットル円錐形チューブに移し、遠心分離機を3,850倍Gで5分間移動する。上清を捨て、摂氏37度に予熱した無菌PBSを10ミリリットル加えます。600ナノメートルで光学濃度を測定し、上皮細胞当たり1つの細菌の感染の多重性に対応する1ミリリットル当たり200,000コロニー形成単位の最終濃度に細胞培養培地を用いた細菌の濃度を調整する。
透過性支持体の補助側に100マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、プレートを摂氏37度でインキュベートし、1時間5%の二酸化炭素をインキュベートして細菌を細胞に取り付け、ピペットでピペットで慎重に取り除き、ALIの状態を回復させます。薬物治療の実験では、細胞培地で希釈した薬物溶液500マイクロリットルをアプリカル側に加える。その後、基底側側に1.5ミリリットルの細胞培地を加えます。
非定型および基底横の媒体の500マイクロリットルを集め、非付着細菌のCFUを査定するためにそれらをプールする。付属または内在化された細菌の生存を評価するには、透過性支持体の各区画に500マイクロリットルの無菌脱イオン冷水を加え、室温で30分間細胞をインキュベートする。凍結サンプルからCFUを評価する場合は、摂氏37度で10分間解凍します。
その後、ピペットの先端を使用して、井戸にあまりにも多くの圧力をかけないように注意して膜表面を削ります。ピペットは、すべての付着コンテンツを削除するために上下.両方の分画から細菌の懸濁液で、PBSトゥイーンで1〜10シリアル希釈を行い、lb寒天プレートに細菌をプレートします。
寒天プレートを摂氏30度で16~72時間インキュベートし、コロニーを数えてCFUを計算します。透過性支持体の頭蓋側側およびバジル側側にヒト気管支上皮細胞とマクロファージの結果として生じる共培養の形態をここに示す。密接結合タンパク質ZO1に対する高いTEER測定および免疫染色により、上皮バリア完全性が証明された。
細菌感染をモデル化するために、P緑分化はCFBE41 oマイナス細胞に接種した。マクロファージは、感染の6時間後に共培養の有端側で観察された。TEERは250オームセンチメートル平方メートルに低下し、ZO1染色によっても示唆された侵害された上皮障壁を示す。
この図に、アピカル側のTHP-1細胞による透過性フィルター細孔および細菌取り込みを介したマクロファージトランスマイグレーションが示されている。THP-1単一培養では、感染後早くも1時間のマクロファージ移行が行われている。一方、共同培養で感染後3時間後に移行が見られた。
トブラマイシンで6時間または20時間治療した感染した共培養物を、共焦点走査レーザー顕微鏡で画像化した。治療を行わない場合、上皮細胞またはマクロファージのいずれかが20時間の感染後に死亡した。顕微鏡写真で6時間の治療の後に見られたにもかかわらず、CFUアッセイは細菌が増殖しないことを実証した。
それにもかかわらず、細菌は20時間の治療後に増殖能力を回復した。単一培養および共培養のTEERも測定した。CFBE41 oマイナス細胞の共培養は、単一培養と比較して上皮バリア完全性の変化を誘発しなかった。
感染時に、TEER値が低下した。この手順を実行する場合、細胞が適切に座っており、フィルター膜が破壊されていないことを確認することが重要です。したがって、細胞の播種手順は慎重に行う必要があります。
このプロトコルに加えて、インサート上の抗生物質のネビュライゼーションは、細菌の生存率が水中条件と比較して変化しているかどうかを確認することを可能にする。
