تم تصميم هذا البروتوكول لمعالجة قضية مهمة جدا وغير محلولة حول كيفية المواد الميكروبية الموجودة والمواد المسببة للحساسية البيئية يمكن أن تنظم تطور التهاب الحساسية. على وجه التحديد، يمكن أن تساعد الأساليب المعروضة هنا في الإجابة عما إذا كانت أنواع الحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في عث الغبار المنزلية مناعية في الجسم الحي وقادرة على تعديل التهاب الرئة اليوسينوفيلي. المزايا الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها بسيطة وفعالة وقابلة للاستنساخ للغاية ويمكن تنفيذها باستخدام الأدوات والمعدات الشائعة الاستخدام.
ويمكن أيضاً استخدام هذه الطرق لتقييم أمراض الرئة الناجمة عن العدوى الفيروسية التنفسية. لي شي، طالب دراسات عليا في مختبري، سيساعد في إظهار الإجراء. تبدأ من خلال عزل RNA الكلي من المواد المسببة للحساسية والحشرات، وغير الحشرات المسببة للحساسية.
نقل كمية مناسبة من العينة في أنبوب مليلتر اثنين تحتوي على 1.4 ملليمتر من الخرز السيراميك، وتجميد الأنابيب في حاوية النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق تقريبا. إضافة ملليلتر واحد من guanidinium thiocyanate القائم على كاشف العزلة RNA إلى كل أنبوب. ثم كسر الحشرة وغير الحشرات الحيوانات الصغيرة مع تعطيل خلية عالية الطاقة في أقصى سرعة لمدة 45 ثانية.
هدئ العينة على الجليد، وكرر هذه العملية مرتين. نقل الحل إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى كل أنبوب، ودوامة العينة.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 14،000 مرات ز لمدة 14 دقيقة في أربع درجات مئوية. ثم نقل المرحلة مائي العليا في أنبوب جديد يحتوي على 500 ميكرولترات من الايزوبروبانول. اخلطي العينة.
ثم الطرد المركزي في 14،000 مرات ز لمدة 14 دقيقة في أربع درجات مئوية. pirate بعناية عظمى. ثم غسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 500 ميكرولترات من 75٪ الإيثانول، والطرد المركزي في 7، 500 مرة ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
إزالة بعناية جميع السوائل. الهواء الجافة بيليه، وحل الجيش الملكي النيبالي مع 20-50 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase. للكشف عن هياكل الحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بها السبل في الجيش الملكي النيبالي الكلي، بقعة اثنين من ميكرولترات عينة 200 نانوغرام لكل ميكرولتر RNA على غشاء النايلون مشحونة بشكل إيجابي.
ربط العينات بالغشاء في 1، 200 ميكروجول بنسبة 100 في crosslinker الأشعة فوق البنفسجية. كرر اكتشاف و crosslinking مرتين أكثر، مما سيؤدي إلى ما مجموعه 1.2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل بقعة. كتلة الربط غير محددة مع 5٪ الحليب في TBS-T لمدة ساعة واحدة في حين تهتز في درجة حرارة الغرفة.
ثم إزالة حل حجب، وإضافة المضادة المضادة مزدوجة تقطعت بهما الحمض النووي الريبي J2 في واحد إلى 1، 000 تخفيف في 1٪ الحليب في TBS-T. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها مع اهتزاز في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، اغسل الغشاء ثلاث مرات بـ TBS-T لمدة خمس دقائق لكل غسل.
إضافة الأجسام المضادة الثانوية، واحتضان الغشاء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم كرر يغسل مع TBS-T. إضافة الركيزة، واحتضان الغشاء لمدة خمس إلى 15 دقيقة حتى إشارة المرجوة مرئية.
وقف رد الفعل عن طريق شطف الغشاء مع الماء المقطر المزدوج. لجمع عينات الرئة، ضع الرئتين على أوراق الأنسجة، واكوس قطعة صغيرة واحدة من كل فص الرئة. ضع كل قطعة في أنبوب مليلتر اثنين يحتوي على الخرز.
لجمع bronchoalveolar lavage ، وتطهير الماوس القتل الرحيم مع 70 ٪ من الإيثانول ، واستخدام مقص لقطع الجلد من المنطقة العليا من البطن إلى الرقبة. سحب بلطف الغدد اللعابية والعضلات sternohyoid وبصرف النظر مع ملقط لفضح القصبة الهوائية. ثم ضع سلسلة نايلون تحته.
إجراء شق في القصبة الهوائية ما يقرب من مليلتر تحت الحنجرة فقط بما فيه الكفاية لإدراج قنية، وعقدة السلسلة حول القصبة الهوائية وقنية. إرفاق حقنة إلى نهاية القنيولا، وتحميلها مع برنامج تلفزيوني جديد-EDTA. ثم حقن وpirate واحد ملليلتر من المحلل في الرئة.
فصل الحقنة من القنية، وإخراج الحل في أنبوب 15 ملليلتر. كرر هذه العملية إلى الجليد مع برنامج تلفزيوني جديد-EDTA، وبركة المرحاض. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 500 مرة ز لمدة سبع دقائق في أربع درجات مئوية.
ثم سجل حجم، ونقل عظمى إلى اثنين من أنابيب 1.5 ملليلتر دون إزعاج بيليه. بعد إعادة بناء الكريه، نقل 150 ميكرولترات إلى لوحة 96-جيدا، والطرد المركزي لوحة لمدة سبع دقائق في 500 مرة ز وأربع درجات مئوية. ثم عكس بسرعة لوحة على ورقة الأنسجة لإزالة افرحة.
وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة في عازلة FACS في وجود 2.4G2 حظر الأجسام المضادة، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد تلطيخ، الطرد المركزي لوحة إلى بيليه الخلايا في 500 مرات ز لمدة سبع دقائق في أربع درجات مئوية. إزالة حل تلطيخ عن طريق عكس لوحة على ورقة الأنسجة.
إضافة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا، ثم كرر الطرد المركزي. إعادة تعليق العينات في 150 ميكرولترات من العازلة FACS، ومن ثم نقلها إلى أنابيب FACS التي تحتوي على 350 ميكرولتر إضافية من العازلة. إضافة 25 ميكرولترات من عد الخرز إلى كل عينة، والمضي قدما مع تحليل تدفق القياسات.
تم فحص وجود هياكل الحمض النووي الريبي الطويلة المزدوجة في عث الغبار المنزلية والحشرات والحيوانات الصغيرة غير الحشرية بواسطة لطخة نقطة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة للماوس مزدوج تقطعت به السبل ومحددة للرنا. تم استخدام RNase III لهضم الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل إلى 12 إلى 15 جزءًا من زوج القاعدة ، والتي لم يتم اكتشافها بواسطة J2. وقد أظهرت قدرة عث الغبار المنزل مجموع الجيش الملكي النيبالي لتحفيز استجابة المناعة الفطرية في الرئتين الماوس من قبل RT-qPCR. العلاج RNase الثالث ألغت النشاط المناعي من عث الغبار البيت مجموع RNA، مشيرا إلى أن هياكل الحمض النووي الريبي المزدوج تقطعت بهم السبل ضرورية للنشاط المناعي الفطري في الرئتين.
تم تقييم التأثير المثبط للعث الغبار المنزل مجموع RNA على تطوير التهاب الرئة من النوع الحاد الثاني مع تحليل FACS. وقد تسبب التهاب الرئة اليوزيني من قبل مستخلصات عث الغبار، التي تم التعامل مع أو بدون RNase الثالث. أدى تدهور أنواع الحمض النووي الريبي الطويلة التي تقطعت بها السبل إلى التهاب رئوي حاد من النوع الثاني ، ينعكس في زيادة أعداد الحمضات في لامغ القصبات والرئتين.
وتجدر الإشارة إلى أن عدد الحمضات في مجموع عث الغبار الذي يعالجه الحمض النووي الريبي هو مماثل للمجموعة المعالجة باستخراج عث الغبار الأصلي الذي يحتوي بشكل داخلي على أنواع الحمض النووي الريبي الطويلة التي تقطعت بها السبل. عند محاولة هذا البروتوكول، كن حذراً جداً عند حقن و تذكر سائل BAL، حيث أن أي تلف يصيب الرئتين في هذه المرحلة قد يغير النتائج النهائية. بالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ELISA لتحليل المحتويات غير الخلوية القابلة للذوبان الموجودة في سائل BAL.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف المواد الميكروبية الأخرى الموجودة في مسببات الحساسية البيئية ، مثل عوامل الحمض النووي الريبي غير المزدوجة التي يمكن أن تنظم تطور التهاب الرئة التحسسي.
