يسمح هذا الإجراء للباحثين بتقييم واختيار جزيئات النانو المثلى للدراسات في الحيوانات الكبيرة والتجارب السريرية. هذه الطريقة البسيطة تساعد في تحديد ما إذا كانت الجسيمات النانوية يمكن أن تستهدف الخلايا السرطانية البشرية في الجسم الحي وإذا كان الأمر كذلك ، ومدى كفاءة الاستهداف. إثبات الإجراءات سيكون الدكتور (شيودان تشين) ، وهو ما بعد الدكتوراه، والسيد أندرو لام، فني أبحاث من مختبرنا.
ملء خزانين غرفة التزاوج مع مياه السمك في المساء وفصل الخزانات العليا باستخدام فواصل. ضع حمار وحشي ذكر في جانب واحد من الغرفة و حمار وحشي أنثى أو اثنتين في جانب آخر من الغرفة. قم بإزالة المقسمات في الساعة 8:00 صباح اليوم التالي.
إضافة محطات التخصيب الاصطناعي وإمالة الغرفة العليا قليلا لخلق منطقة ضحلة من المياه. السماح للحمار الوحشي أن تتكاثر لمدة ثلاث إلى أربع ساعات وجمع البيض من الغرفة السفلية عن طريق صب الماء من خلال شبكة شبكة. نقل البيض إلى طبق بيتري مع ما لا يزيد عن 200 بيضة في الطبق الواحد.
إزالة أي البيض الميت أو غير المخصب. ملء طبق ثلثي كامل مع مياه السمك الطازجة، ووضعها في الحاضنة. بعد 24 ساعة، قم بإزالة الطبق من الحاضنة وإزالة أكبر قدر ممكن من الماء من الطبق.
إضافة بضع قطرات من مليغرام واحد لكل ميل pronase ميليلي ودوامة بلطف الطبق. عندما تظهر على التشوهات علامات التفكك، الماصات الأجنة صعودا وهبوطا عدة مرات لكسر chorions وإطلاق الأجنة. مرة واحدة في معظم الأجنة هي خارج chorions، على الفور إضافة مياه السمك العذبة لإنهاء العملية.
شطف الأجنة مع مياه السمك ثلاث مرات لإزالة chorions العائمة العودة الأجنة إلى الحاضنة. جعل حل agarose 3٪ عن طريق إضافة ثلاثة غرامات من الأغاروز الكهربائية الصف إلى 100 ملليلتر من ماء السمك autoclaved. الميكروويف agarose والماء حتى يتم حل agarose تماما.
لإنشاء لوحة الحقن، صب حل agarose الساخنة في طبق بيتري حتى ثلاثة أرباع كاملة ووضع قالب الحقن الصغيرة على agarose. بعد أن تتوطد agarose، وإزالة بعناية العفن. ملء لوحة الحقن الناتجة مع ماء السمك autoclaved وتخزينها في أربع درجات مئوية.
لجعل الحقن الإبر، سحب البورسليكات الشعرية الزجاجية واحد ملليمتر القطر الخارجي من قبل 0.78 ملليمتر على سحب ماصة. تخزين الإبر حقن على المعجون في طبق بيتري الكبيرة التي تم مسحها بمنشفة الإيثانول. قبل حصاد خلايا HeLa، إعادة احضنة صفيحة الحقن ومياه السمك في الحاضنة عند 35.5 درجة مئوية.
30 دقيقة إلى ساعة قبل زرع، حصاد خلايا هيلا. العمل في غطاء لثقافة الأنسجة، وإزالة المتوسطة من القارورة عن طريق الطموح. شطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة جميع آثار المتوسطة.
إضافة ثلاثة ملليلترات من التربسين EDTA العقيمة إلى القارورة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. مراقبة القارورة تحت المجهر لرصد التقدم المحرز في الهضم الأنزيمي. عندما يتم تعليق ما يقرب من 80٪ من الخلايا، إضافة ستة إلى ثمانية ملليلتر من متوسطة النمو إلى القارورة.
جمع الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف ونقلها إلى أنبوب معقم 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 135 مرة G لمدة خمس دقائق. التعرق و resuspend خلايا هيلا في ثلاثة ملليلتر من متوسط النمو الكامل.
بعد تكرار خطوات الغسيل مرتين، resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من متوسطة النمو الكامل. ثم عد الخلايا تحت المجهر باستخدام مقياس الهيموسيت. بعد الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى، إزالة supernatant.
resuspend الخلايا في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge بتركيز من خمس مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر. الحفاظ على الخلايا الدافئة من خلال عقد الأنبوب في يد واحدة عند نقل إلى منشأة الأسماك. باستخدام ماصة بلاستيكية، ضع أجنة الحمار الوحشي على لوحة الحقن.
وضع الأجنة على جوانبها مع الأمامي تواجه إلى الأمام الانحياز إلى الأخاطر على لوحة. بدوره على مصدر الهواء والحقن الصغرى. بعد استرجاع خلايا HeLa من الحاضنة ، والماصات الخلايا صعودا وهبوطا 20 إلى 30 مرة باستخدام P200.
باستخدام تلميح هلام تحميل مع نهاية قطع، على الفور تحميل ثلاثة microliters من تعليق خلية هيلا في واحدة من حقن الإبر. أدخل الإبرة في حامل الإبرة ووضع لوحة الحقن تحت المجهر. حقن خليط الخلية في الجنين في منطقة الأوعية الدموية تحت تجويف ما بينتين عن طريق الضغط على دواسة القدم.
ثم ماصة بضع قطرات من الماء السمك العقيم على الجنين. لمواصلة عملية الحقن، استخدم اليد غير المهيمنة لنقل صفيحة الحقن إلى الجنين التالي، ثم استخدم اليد المهيمنة لتمديد المحاقن وتراجعه مع الضغط في الوقت نفسه على دواسة القدم. الانتهاء من حقن جميع الأجنة على لوحة وغسل الأجنة مع مياه السمك العقيمة في طبق بيتري عقيمة.
احتضان الطبق على الفور في 35.5 درجة مئوية. بعد ثلاث ساعات، فحص الأجنة المحقونة وإزالة تلك الميتة. في اليوم التالي، جعل حقن الإبر لجسيمات نانو وتخزينها على المعجون في طبق بيتري كبيرة.
العمل تحت المجهر الفلوري، والتقاط بعناية الأجنة مع الانبثاث الذيل ووضعها على لوحة حقن جديدة مع مياه السمك العقيمة. لكل حمار وحشي مع الانبثاث الذيل، وحقن إما حل الجسيمات النانوية أو الماء وراء العين. أيضا حقن حل الجسيمات النانوية وراء عيون الحمار الوحشي في المجموعة التحكم التي لم تتلق عمليات زرع HeLa واحتضان جميع الأجنة المحقونة في 35.5 درجة مئوية.
مباشرة بعد الحقن ومرة أخرى في فترات 30 إلى 60 دقيقة، نقل اثنين إلى ثلاثة أجنة إلى طبق بيتري وشل حركتها عن طريق إضافة خمس قطرات من محلول MS222 المخفف. بمجرد أن تتوقف الأجنة عن السباحة، قم بإزالة معظم الماء للسماح للأجنة بالاستلقاء على جوانبها. باستخدام ماصة مع فرشاة ناعمة رقيقة تعلق على نهايتها، محاذاة الأجنة بحيث تكمن مع الأمامي تواجه إلى الأمام وعين واحدة فقط مرئية.
باستخدام التكبير 2X، التقاط صور من الجنين كله على قنوات الأحمر والأزرق، ومشرق. لالتقاط منطقة الذيل، صورة الأجنة في التكبير 6.4X. ركّز الجنين تحت القناة الحمراء لتجنب نزيف الجسيمات النانوية.
بعد التصوير مباشرة، أضف مياه السمك العذبة إلى الأجنة واعيدها إلى الحاضنة. تم تصوير الأجنة المحقونة والمسيطر عليها باستخدام مجهر فلوري. النقاط الحمراء هي خلايا سرطان عنق الرحم البشرية النقيلي في حين أن النقاط الزرقاء تمثل جزيئات نانو.
في مجموعة تحكم واحدة، كانت أسماك الحمار الوحشي التي تم حقنها بالخلايا السرطانية ولكن ليس جزيئات النانو، وخلايا HeLa الفلورية مرئية في القناة الحمراء ولم يتم الكشف عن أي إشارات فلورية محددة في القناة الزرقاء. وفي مجموعة التحكم الأخرى، تم حقن أسماك الحمار الوحشي بجزيئات نانو، ولكن ليس بالخلايا السرطانية. ووزعت جزيئات نانوية فلورية زرقاء في جميع أنحاء الدورة الدموية.
لم يكن هناك فلورانس أحمر محدد مرئي. عندما تم حقن سمك الحمار الوحشي مع الانبثاث الذيل مع جزيئات نانو، تظهر الصور المتراكبة من القنوات الحمراء والزرقاء التعريب المشترك لخلايا هيلا والجسيمات النانوية. بعد تنفيذ هذه الطريقة، يمكننا تحليل عبء الورم وبقاء الخلايا السرطانية، والحيوانات مع وبدون حقن جزيئات النانو لضبط قدرتها على قتل الخلايا السرطانية.
هذه التقنية قد تسهل اختيار الجسيمات النانوية المثلى التي يمكن أن تعترف على وجه التحديد الخلية السرطانية في الجسم الحي مما يؤدي إلى الكشف المبكر عن السرطان ونقائل السرطان.
