Este procedimento permite que os pesquisadores avaliem e selecionem nanopartículas ideais para estudos em animais de grande porte e ensaios clínicos. Este método simples ajuda a determinar se a nanopartícula pode atingir as células cancerígenas humanas in vivo e, se sim, quão eficiente é o alvo. Demonstrando os procedimentos estarão o Dr. Xiodan Qin, um pós-doutor, e o Sr. Andrew Lam, um técnico de pesquisa do nosso laboratório.
Encha dois tanques de acasalamento de câmara com água de peixe à noite e separe os tanques superiores usando divisores. Coloque um zebrafish macho em um lado da câmara e uma ou duas fêmeas zebrafish em outro lado da câmara. Remova os divisores às 8:00 da manhã seguinte.
Adicione plantas de enriquecimento artificial e incline ligeiramente a câmara superior para criar uma área rasa de água. Deixe o zebrafish se reproduzir por três a quatro horas e coletar os ovos da câmara inferior derramando a água através de uma rede de malha. Transfira os ovos para uma placa de Petri com no máximo 200 ovos por prato.
Remova qualquer ovo morto ou não fertilizado. Encha o prato dois terços cheio de água de peixe fresco, e coloque-o na incubadora. Após 24 horas, retire o prato da incubadora e retire o máximo de água possível do prato.
Adicione algumas gotas de um miligrama por solução de pronase mililitro e gire suavemente o prato. Quando os acordes mostram sinais de desintegração, pipeta os embriões para cima e para baixo algumas vezes para quebrar os acordes e liberar os embriões. Uma vez que a maioria dos embriões estão fora dos acordes, adicione imediatamente água de peixe fresco para encerrar o processo.
Enxágüe os embriões com água de peixe três vezes para remover os acordes flutuantes Devolva os embriões à incubadora. Faça uma solução de 3% de agarose adicionando três gramas de agarose de grau de eletroforênese a 100 mililitros de água de peixe autoclaved. Micro-ondas a ágarose e água até que a agarose seja completamente dissolvida.
Para criar a placa de injeção, despeje a solução de agarose quente em uma placa de Petri até que esteja três quartos cheia e coloque o molde de micro injeção na agarose. Depois que a agarose se solidificar, remova cuidadosamente o molde. Encha a placa de injeção resultante com água de peixe autoclaved e armazene-a a quatro graus Celsius.
Para fazer as agulhas de injeção, puxe capilares de vidro borossilicato de um milímetro de diâmetro externo por 0,78 milímetros em um puxador de pipeta. Guarde as agulhas de injeção em massa em uma grande placa de Petri que foi limpa com uma toalha de etanol. Antes de colher as células HeLa, reaqueça a placa de injeção e a água de peixe na incubadora a 35,5 graus Celsius.
30 minutos a uma hora antes do transplante, colher as células HeLa. Trabalhando em uma capa de cultura de tecido, remova o meio do frasco por aspiração. Enxágüe as células com PBS estérei para remover todos os traços do meio.
Adicione três mililitros de trippsina estéril EDTA ao frasco e incuba-o a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Observe o frasco sob o microscópio para monitorar o progresso da digestão enzimática. Quando aproximadamente 80% das células forem suspensas, adicione seis a oito mililitros de meio de crescimento ao frasco.
Colete as células por pipetação suavemente e transfira-as para um tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 135 vezes G por cinco minutos. Aspire o supernasce e resuspenda as células HeLa em três mililitros de meio de crescimento completo.
Depois de repetir as etapas de lavagem duas vezes, resuspense as células em um mililitro de meio de crescimento completo. Em seguida, conte as células sob o microscópio usando um hemótmetro. Depois de centrifugar as células novamente, remova o supernante.
Resuspend as células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a uma concentração de cinco vezes 10 para a sétima célula por mililitro. Mantenha as células aquecidas segurando o tubo em uma mão ao transportar para a instalação de peixes. Usando uma pipeta de plástico, coloque os embriões de zebrafish na placa de injeção.
Coloque embriões em seus lados com o anterior voltado para a frente alinhados às ranhuras na placa. Ligue a fonte de ar e o micro injetor. Depois de recuperar as células HeLa da incubadora, pipeta as células para cima e para baixo 20 a 30 vezes usando um P200.
Usando uma ponta de carregamento de gel com uma extremidade cortada, carregue imediatamente três microliters da suspensão da célula HeLa em uma das agulhas de injeção. Insira a agulha no suporte da agulha e coloque a placa de injeção sob o microscópio. Injete a mistura celular no embrião na área vascularizada sob a cavidade perivitelline pressionando o pedal do pé.
Em seguida, pipeta algumas gotas de água de peixe estéril sobre o embrião. Para continuar o processo de injeção, use a mão não dominante para mover a placa de injeção para o próximo embrião e, em seguida, use a mão dominante para estender e retrair o injetor enquanto pressiona simultaneamente o pedal do pé. Finalize a injeção de todos os embriões na placa e lave os embriões com água de peixe estéril em uma placa de Petri estéril.
Incubar imediatamente o prato a 35,5 graus Celsius. Depois de três horas, examine os embriões injetados e remova os mortos. No dia seguinte, faça agulhas de injeção para as nanopartículas e armazene-as em massa em uma grande placa de Petri.
Trabalhando sob um microscópio fluorescente, pegue cuidadosamente embriões com metástases traseiras e coloque-os em uma nova placa de injeção com água de peixe estéril. Para cada zebrafish com uma metástase traseira, injete solução de nanopartículas ou água atrás do olho. Também injete solução de nanopartículas atrás dos olhos do zebrafish no grupo controle que não recebeu transplantes de HeLa e incuba todos os embriões injetados a 35,5 graus Celsius.
Imediatamente após a injeção e novamente em intervalos de 30 a 60 minutos, transfira dois a três embriões para uma placa de Petri e imobilize-os adicionando cinco gotas de solução MS222 diluída. Uma vez que os embriões parem de nadar, remova a maior parte da água para permitir que os embriões deitem-se em seus lados. Usando uma pipeta com uma fina escova macia presa à extremidade, alinhe os embriões para que eles se deitem com o anterior voltado para a frente e apenas um olho visível.
Usando ampliação 2X, capture imagens de todo o embrião nos canais vermelho, azul e Brightfield. Para capturar a área da cauda, imagem os embriões em 6.4X de ampliação. Concentre o embrião sob o canal vermelho para evitar o sangramento de nanopartículas.
Imediatamente após a imagem, adicione água de peixe fresco aos embriões e devolva-os à incubadora. Embriões de zebrafish injetados e controlados foram imagens usando um microscópio fluorescente. Os pontos vermelhos são células cancerígenas do colossticas humanas, enquanto os pontos azuis representam as nanopartículas.
Em um grupo controle, zebrafish que foram injetados com células cancerosas, mas não nanopartículas, as células HeLa fluorescentes eram visíveis no canal vermelho e nenhum sinal fluorescente específico foi detectado no canal azul. No outro grupo controle, os zebrafish foram injetados com nanopartículas, mas não com células cancerosas. Nanopartículas fluorescentes azuis foram distribuídas por todo o sistema circulatório.
Nenhuma florescência vermelha específica era visível. Quando zebrafish com metástases traseiras foram injetados com nanopartículas, imagens sobrepostas dos canais vermelho e azul mostram a co-localização de células HeLa e nanopartículas. Depois de realizar este método, podemos analisar a carga tumoral e a sobrevivência das células cancerosas, os animais com e sem injetar nanopartículas para ajustar sua capacidade de matar células cancerígenas.
Essa técnica pode facilitar a seleção da nanopartícula ideal que pode reconhecer especificamente a célula cancerígena in vivo levando à detecção precoce de câncer e metástase do câncer.
