Dieses Verfahren ermöglicht es Forschern, optimale Nanopartikel für Studien an großen Tieren und klinischen Studien zu evaluieren und auszuwählen. Diese einfache Methode hilft zu bestimmen, ob das Nanopartikel die menschlichen Krebszellen in vivo angreifen kann und wenn ja, wie effizient das Targeting ist. Die Verfahren werden Dr.Xiodan Qin, ein Postdoc, und Mr.Andrew Lam, ein Forschungstechniker aus unserem Labor, demonstrieren.
Füllen Sie abends zwei Kammerpaarungstanks mit Fischwasser und trennen Sie die oberen Tanks mit Trennwänden. Legen Sie einen männlichen Zebrafisch in eine Seite der Kammer und ein oder zwei Weibchen Zebrafische in eine andere Seite der Kammer. Entfernen Sie die Trennwände um 8:00 Uhr am nächsten Morgen.
Fügen Sie künstliche Anreicherungsanlagen hinzu und neigen Sie die obere Kammer leicht, um eine flache Wasserfläche zu schaffen. Lassen Sie die Zebrafische drei bis vier Stunden züchten und sammeln Sie die Eier aus der unteren Kammer, indem Sie das Wasser durch ein Netz gießen. Die Eier auf eine Petrischale mit nicht mehr als 200 Eiern pro Gericht geben.
Entfernen Sie alle toten oder unbefruchteten Eier. Füllen Sie das Gericht zu zwei Dritteln voll mit frischem Fischwasser und legen Sie es in den Brutkasten. Nach 24 Stunden die Schale aus dem Brutkasten entfernen und so viel Wasser wie möglich aus der Schale entfernen.
Fügen Sie ein paar Tropfen von einem Milligramm pro Milliliter Pronase Lösung und sanft wirbeln die Schale. Wenn die Krähen Anzeichen von Zerfall zeigen, pipette die Embryonen ein paar Mal auf und ab, um die Krähen zu brechen und die Embryonen freizusetzen. Sobald die meisten Embryonen aus den Kränzen sind, fügen Sie sofort frisches Fischwasser hinzu, um den Prozess zu beenden.
Spülen Sie die Embryonen dreimal mit Fischwasser, um die schwimmenden Krähen zu entfernen, bringen Sie die Embryonen in den Brutkasten zurück. Machen Sie eine 3%Agarose-Lösung, indem Sie drei Gramm Elektrophorese-Grade-Agarose zu 100 Milliliter autoklaviertem Fischwasser hinzufügen. Mikrowelle die Agarose und Wasser, bis die Agarose vollständig gelöst ist.
Um die Injektionsplatte zu erstellen, gießen Sie heiße Agarose-Lösung in eine Petrischale, bis sie drei Viertel voll ist und legen Sie die Mikro-Spritzguss-Form auf die Agarose. Nachdem die Agarose verfestigt hat, entfernen Sie die Form vorsichtig. Füllen Sie die resultierende Injektionsplatte mit autoklaviertem Fischwasser und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.
Um die Injektionsnadeln herzustellen, ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren einen Millimeter Außendurchmesser um 0,78 Millimeter auf einem Pipettenzieher. Bewahren Sie die Injektionsnadeln auf dem Putte in einer großen Petrischale auf, die mit einem Ethanoltuch abgewischt wurde. Vor der Ernte der HeLa-Zellen die Injektionsplatte und das Fischwasser im Brutkasten bei 35,5 Grad Celsius aufwärmen.
30 Minuten bis eine Stunde vor der Transplantation die HeLa-Zellen ernten. Arbeiten in einer Gewebekultur Haube, entfernen Sie das Medium aus dem Kolben durch Aspiration. Spülen Sie die Zellen mit sterilem PBS, um alle Spuren des Mediums zu entfernen.
Fügen Sie drei Milliliter steriles Trypsin EDTA in den Kolben und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Beobachten Sie den Kolben unter dem Mikroskop, um den Fortschritt der enzymatischen Verdauung zu überwachen. Wenn etwa 80% der Zellen suspendiert sind, fügen Sie sechs bis acht Milliliter Wachstumsmedium zum Kolben hinzu.
Sammeln Sie die Zellen durch sanftePipettieren und übertragen Sie sie in ein 15 Milliliter steriles Rohr. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 135 mal G für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die HeLa-Zellen in drei Millilitern des vollständigen Wachstumsmediums wieder aus.
Nachdem Sie die Waschschritte zweimal wiederholt haben, setzen Sie die Zellen in einem Milliliter vollgewichtigen Mediums wieder aus. Dann zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer. Entfernen Sie nach dem erneuten Zentrifugieren der Zellen den Überstand.
Setzen Sie die Zellen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einer Konzentration von fünf mal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter aus. Halten Sie die Zellen warm, indem Sie die Röhre in einer Hand halten, wenn Sie zur Fischanlage transportieren. Mit einer Plastikpipette die Zebrafisch-Embryonen auf die Injektionsplatte legen.
Legen Sie Embryonen auf ihre Seiten mit dem vorderen Nachvorne nach vorne ausgerichtet an den Rillen auf der Platte ausgerichtet. Schalten Sie die Luftquelle und den Mikroinjektor ein. Nachdem Sie die HeLa-Zellen aus dem Inkubator abgerufen haben, pipettedien die Zellen 20 bis 30 Mal mit einem P200.
Mit einer Gel-Ladespitze mit Schnittende sofort drei Mikroliter der HeLa-Zellsuspension in eine der Injektionsnadeln laden. Setzen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein und legen Sie die Injektionsplatte unter das Mikroskop. Injizieren Sie das Zellgemisch in den Embryo im vaskularisierten Bereich unter der Perivitellinehöhle, indem Sie das Fußpedal drücken.
Dann Pipette ein paar Tropfen steriles Fischwasser auf den Embryo. Um den Injektionsprozess fortzusetzen, verwenden Sie die nicht-dominante Hand, um die Injektionsplatte zum nächsten Embryo zu bewegen, und verwenden Sie dann die dominante Hand, um den Injektor zu verlängern und zurückzuziehen, während Sie gleichzeitig das Fußpedal drücken. Die Injektion aller Embryonen auf dem Teller beenden und die Embryonen mit sterilem Fischwasser in eine sterile Petrischale waschen.
Sofort bebrüten Sie das Gericht bei 35,5 Grad Celsius. Nach drei Stunden die injizierten Embryonen untersuchen und die Toten entfernen. Am nächsten Tag Injektionsnadeln für die Nanopartikel herstellen und auf Demtie in einer großen Petrischale aufbewahren.
Unter einem Fluoreszenzmikroskop arbeiten, nehmen Sie Embryonen mit Schwanzmetastasen sorgfältig auf und legen Sie sie auf eine neue Injektionsplatte mit sterilem Fischwasser. Für jeden Zebrafisch mit einer Schwanzmetastasierung entweder Nanopartikellösung oder Wasser hinter dem Auge injizieren. Injizieren Sie auch Nanopartikellösung hinter den Augen des Zebrafisches in die Kontrollgruppe, die keine HeLa-Transplantationen erhalten hat und alle injizierten Embryonen bei 35,5 Grad Celsius inkubieren.
Unmittelbar nach der Injektion und wieder in 30 bis 60 Minuten Intervallen zwei bis drei Embryonen auf eine Petrischale übertragen und durch Zugabe von fünf Tropfen verdünnter MS222-Lösung immobilisieren. Sobald die Embryonen aufhören zu schwimmen, entfernen Sie den größten Teil des Wassers, damit die Embryonen auf ihren Seiten liegen. Mit einer Pipette mit einem dünnen weichen Pinsel an seinem Ende befestigt, richten Sie die Embryonen so aus, dass sie mit dem vorderen nach vorne gerichteten und nur einem Auge sichtbar liegen.
Erfassen Sie mit der 2x-Vergrößerung Bilder des gesamten Embryos auf roten, blauen und Brightfield-Kanälen. Um den Schwanzbereich zu erfassen, stellen Sie die Embryonen mit 6,4-facher Vergrößerung ab. Fokussieren Sie den Embryo unter dem roten Kanal, um das Bluten von Nanopartikeln zu vermeiden.
Unmittelbar nach der Bildgebung frisches Fischwasser zu den Embryonen geben und in den Brutkasten zurückbringen. Injizierte und kontrollierende Zebrafisch-Embryonen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Die roten Punkte sind metastasierende menschliche Gebärmutterhalskrebszellen, während die blauen Punkte die Nanopartikel darstellen.
In einer Kontrollgruppe waren Zebrafische, die mit Krebszellen, aber nicht mit Nanopartikeln injiziert wurden, fluoreszierende HeLa-Zellen im roten Kanal sichtbar und es wurden keine spezifischen Fluoreszenzsignale im blauen Kanal nachgewiesen. In der anderen Kontrollgruppe wurden Zebrafische mit Nanopartikeln injiziert, nicht jedoch mit Krebszellen. Blaue fluoreszierende Nanopartikel wurden im Kreislaufsystem verteilt.
Eine bestimmte rote Blütenpracht war nicht zu sehen. Wenn Zebrafische mit Schwanzmetastasen mit Nanopartikeln injiziert wurden, zeigen überlagerte Bilder aus den roten und blauen Kanälen die Kolokalisierung von HeLa-Zellen und Nanopartikeln. Nach der Durchführung dieser Methode können wir die Tumorbelastung und das Überleben von Krebszellen, die Tiere mit und ohne Injektion von Nanopartikeln analysieren, um ihre Fähigkeit, Krebszellen abzutöten, anzupassen.
Diese Technik kann die Auswahl des optimalen Nanopartikels erleichtern, das die Krebszelle in vivo gezielt erkennen kann, was zur Früherkennung von Krebs und Krebsmetastasen führt.
