이 절차는 연구원이 큰 동물 및 임상 시험에서 연구를 위한 최적 나노 입자를 평가하고 선택할 수 있게 합니다. 이 간단한 방법은 나노 입자가 생체 내에서 인간 암세포를 표적으로 할 수 있는지 여부와 그렇다면 타겟팅이 얼마나 효율적인지 결정하는 데 도움이됩니다. 절차를 시연하는 것은 포스트닥인 Xiodan Qin 박사와 실험실의 연구 기술자인 앤드류 램(Andrew Lam) 씨가 될 것입니다.
저녁에 물고기 물로 두 챔버 짝짓기 탱크를 채우고 칸막이를 사용하여 상부 탱크를 분리합니다. 수컷 얼룩말물고기를 챔버의 한쪽에 놓고 한두 마리의 암컷 얼룩말물고기를 챔버의 다른 쪽에 놓습니다. 다음날 아침 8:00에 칸막이를 제거하십시오.
인공 농축 식물을 추가하고 물 얕은 영역을 만들기 위해 상단 챔버를 약간 기울입니다. 제브라피쉬가 3~4시간 동안 번식하고 메쉬 그물을 통해 물을 부어 아래방에서 알을 모을 수 있도록 한다. 계란을 접시당 200개 이하의 달걀과 함께 페트리 요리로 옮기습니다.
죽은 또는 수정되지 않은 계란을 제거합니다. 신선한 생선 물로 가득 찬 요리 의 3 분의 2를 채우고 인큐베이터에 넣습니다. 24시간 후 인큐베이터에서 접시를 제거하고 접시에서 가능한 한 많은 물을 제거합니다.
밀리리터 pronase 용액 당 1 밀리그램 을 몇 방울 더 넣고 부드럽게 접시를 소용돌이. chorions가 붕괴의 표시를 보일 때, 배아를 위아래로 몇 번 피펫하여 축을 분해하고 배아를 방출합니다. 배아의 대부분이 축축해지면 즉시 신선한 생선물을 추가하여 과정을 종료합니다.
물고기 물로 배아를 세 번 헹구면 부동 축고를 제거하여 배아를 인큐베이터로 돌려보도록 한다. 3%의 아가로즈 용액을 3그램의 전기전도급 아가로즈를 100밀리리터에 첨가하여 100밀리리터의 오토클레이브 어수질을 추가하십시오. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 아가로즈와 물을 전자레인지에 담그고 있습니다.
사출판을 만들려면 뜨거운 아가로즈 용액을 페트리 접시에 붓고 3쿼터가 가득 차서 아가로즈에 마이크로 사출 몰드를 놓습니다. 아가로즈가 고화된 후, 조심스럽게 금형을 제거합니다. 그 결과 주입판을 오토클레이브 생선물로 채우고 섭씨 4도에 보관하십시오.
주입 바늘을 만들려면, 보로실리케이트 유리 모세혈관을 파이펫 풀러에 0.78 밀리미터로 1밀리미터 외부 직경을 당깁니다. 에탄올 타월로 닦아 버린 큰 페트리 접시에 퍼티에 주사 바늘을 보관하십시오. HeLa 세포를 수확하기 전에 인큐베이터에서 주입 판과 생선물을 섭씨 35.5도에서 다시 데우습니다.
이식 하기 전에 30 분에서 1 시간, HeLa 세포를 수확. 조직 배양 후드에서 작업, 포부에 의해 플라스크에서 매체를 제거. 멸균 PBS로 세포를 헹구어 배지의 모든 흔적을 제거합니다.
플라스크에 멸균 트립신 EDTA 3 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 3~5분 동안 배양합니다. 현미경의 밑에 플라스크를 관찰하여 효소 소화의 진행 상황을 모니터링합니다. 세포의 약 80%가 일시 중단되면 플라스크에 6~8밀리리터의 성장 배지를 추가합니다.
부드럽게 파이펫으로 세포를 수집하고 15 밀리리터 멸균 튜브로 전송합니다. 5 분 동안 135 배 G에서 튜브를 원심 분리합니다. 슈퍼나탈자를 흡인시키고 완전한 성장 배지의 3밀리리터에서 HeLa 세포를 재보중단한다.
세척 단계를 두 번 반복 한 후 완전한 성장 매체의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 혈종계를 사용하여 현미경으로 세포를 계산합니다. 세포를 다시 원심 분리한 후 상체를 제거합니다.
밀리리터당 7세포에 대해 1.5밀리리터 마이크로센심분리기 튜브의 세포를 5회 10회 농도로 재보페한다. 물고기 시설로 운반 할 때 한 손에 튜브를 잡고 세포를 따뜻하게 유지합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 제브라피시 배아를 사출 판에 놓습니다.
전방을 향한 전방이 플레이트의 홈에 정렬되어 측면에 배아를 놓습니다. 공기 소스와 마이크로 인젝터를 켭니다. 인큐베이터에서 HeLa 세포를 검색한 후 P200을 사용하여 세포를 20~30회 위아래로 피펫합니다.
절단 끝이있는 젤 로딩 팁을 사용하여 즉시 HeLa 세포 서스펜션의 3 마이크로 리터를 주입 바늘 중 하나에 로드합니다. 바늘을 바늘 홀더에 삽입하고 현미경 아래에 주사 판을 놓습니다. 발 페달을 눌러 각성 충치 아래 혈관 이내의 배아에 세포 혼합물을 주입한다.
그런 다음 배아에 멸균 생선 물 몇 방울을 피펫. 주입 과정을 계속하려면, 비 지배적 인 손을 사용하여 사출 판을 다음 배아로 이동한 다음 지배적 인 손을 사용하여 발 페달을 동시에 누르는 동안 인젝터를 확장하고 철회하십시오. 접시에 있는 모든 배아의 주입을 완료하고 멸균 생선물로 배아를 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
즉시 섭씨 35.5도에서 접시를 배양합니다. 3 시간 후에 주입 된 배아를 검사하고 죽은 배아를 제거하십시오. 다음 날, 나노 입자에 대한 주입 바늘을 만들고 큰 페트리 접시에 퍼티에 저장합니다.
형광 현미경으로 작업, 조심스럽게 꼬리 전이와 배아를 데리러 멸균 물고기 물새로운 주사 판에 배치. 꼬리 전이가 있는 각 얼룩말물고기에 대해 나노 입자 용액또는 눈 뒤에 물을 주입하십시오. 또한 HeLa 이식을 받지 못한 대조군에서 제브라피시의 눈 뒤에 나노 입자 용액을 주입하고 주입된 모든 배아를 섭씨 35.5도에서 배양한다.
주입 직후 30~60분 간격으로 2~3개의 배아를 페트리 접시에 옮기고 희석된 MS222 용액 5방울을 추가하여 고정합니다. 배아가 수영을 중단하면 배아가 측면에 누워 있도록 대부분의 물을 제거하십시오. 끝에 얇은 부드러운 브러시가 부착된 파이펫을 사용하여 배아를 정렬하여 전방을 향하게 하고 한쪽 눈만 볼 수 있도록 합니다.
2배 배율을 사용하여 빨간색, 파란색 및 브라이트필드 채널에서 전체 배아의 이미지를 캡처합니다. 꼬리 영역을 캡처하려면 배아를 6.4배 배율로 이미지화합니다. 나노 입자의 출혈을 피하기 위해 적색 채널 아래에 배아를 집중시킵니다.
이미징 직후, 배아에 신선한 생선물을 넣고 인큐베이터로 돌려보라고 한다. 주입 및 제어 제브라피시 배아는 형광 현미경을 사용하여 이미지되었다. 적색점은 전이성 인간 자궁경부암세포이며, 청색점은 나노 입자를 나타낸다.
한 대조군에서는, 암세포로 주입되었지만 나노 입자가 아닌 제브라피시, 형광 헬라 세포는 적색 채널에서 보였으며 특정 형광 신호는 청색 채널에서 검출되지 않았다. 다른 대조군에서는, 제브라피쉬는 나노 입자로 주입되었지만 암세포에서는 주입되지 않았다. 청색 형광 나노 입자는 순환 계통 전체에 분포하였다.
구체적인 붉은 꽃집이 보이지 않았다. 꼬리 전이가 있는 제브라피쉬가 나노 입자로 주입되었을 때, 적색 및 파란색 채널의 오버레이 이미지는 HeLa 세포와 나노 입자의 공동 국소화를 보여줍니다. 이 방법을 수행한 후, 우리는 암세포를 죽이는 그들의 능력을 조정하기 위하여 나노 입자를 주입하는 안팎으로 종양 부담 및 암세포 생존, 동물을 분석할 수 있습니다.
이 기술은 암과 암 전이의 조기 발견으로 이어지는 생체 내에서 암세포를 구체적으로 인식할 수 있는 최적의 나노입자의 선택을 용이하게 할 수 있다.
