Эта процедура позволяет исследователям оценить и выбрать оптимальные наночастицы для исследований на крупных животных и клинических испытаний. Этот простой метод помогает определить, может ли наночастица быть нацелена на раковые клетки человека in vivo, и если да, то насколько эффективна таргетинг. Демонстрация процедур будет д-р Xiodan Цинь, postdoc, и г-н Эндрю Лам, научный специалист из нашей лаборатории.
Заполните два камерных брачных резервуара рыбной водой вечером и разделите верхние резервуары с помощью разделителей. Поместите самца зебры в одну сторону камеры и одну или две самки зебры в другую сторону камеры. Удалите разделители в 8:00 утра на следующее утро.
Добавьте искусственные обогатительный завод и слегка наклоните верхнюю камеру, чтобы создать неглубокую площадь воды. Разрешить зебры размножаться в течение трех-четырех часов и собирать яйца из нижней камеры, наливая воду через сетку. Перенесите яйца в чашку Петри с не более чем 200 яйцами на блюдо.
Удалите мертвые или неутилизованные яйца. Заполните блюдо на две трети свежей рыбной водой и поместите его в инкубатор. Через 24 часа вынюхив блюдо из инкубатора и удалите из блюда как можно больше воды.
Добавьте несколько капель одного миллиграмма на миллилитр проназ раствора и аккуратно закружить блюдо. Когда хорионы проявляют признаки распада, пипетки эмбрионов вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать хорионов и освободить эмбрионы. После того, как большинство эмбрионов из хорионов, немедленно добавить пресную рыбную воду, чтобы прекратить процесс.
Промыть эмбрионы рыбной водой три раза, чтобы удалить плавающие хорионы Вернуть эмбрионы в инкубатор. Сделать 3%agarose раствор, добавив три грамма электрофорез-класса агарозы до 100 миллилитров автоматической рыбной воды. Микроволновая печь агарозы и воды, пока агароза полностью растворяется.
Чтобы создать инъекционной пластины, залить горячим раствором агарозы в чашку Петри, пока она не три четверти полной и место микро-формы инъекций на агарозу. После того, как агароза затвердеет, аккуратно удалите плесень. Заполните полученную инъекционной пластину автоклавной рыбной водой и храните ее при четырех градусах Цельсия.
Чтобы сделать инъекционные иглы, потяните борозиликатные стеклянные капилляры диаметром один миллиметр внешнего диаметра на 0,78 миллиметра на пипетку. Храните инъекционные иглы на путте в большой чашке Петри, которая была вытерта этанолом полотенцем. Перед сбором клеток HeLa, rewarm инъекционной пластины и рыбной воды в инкубаторе при 35,5 градусов по Цельсию.
За 30 минут до часа до трансплантации, урожай клеток HeLa. Работая в капюшоне культуры тканей, удалить среду из колбы путем аспирации. Промыть клетки стерильным PBS, чтобы удалить все следы среды.
Добавьте три миллилитров стерильного трипсина ЭДТА в колбу и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение трех-пяти минут. Наблюдайте за колбой под микроскопом, чтобы следить за ходом энзиматической пищеварения. Когда примерно 80% клеток приостановлены, добавьте шесть-восемь миллилитров среднего роста в колбу.
Соберите клетки, аккуратно трубя и перенесите их в стерильную трубку на 15 миллилитров. Центрифуга трубки при 135 раз G в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно изутовить клетки HeLa в трех миллилитров полной среды роста.
После повторения мытья шаги в два раза, повторного перерасхода клеток в один миллилитр полной среды роста. Затем подсчитайте клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра. После центрифугирования клеток снова, удалить супернатант.
Повторное течение клеток в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки при концентрации в пять раз 10 до седьмой клетки на миллилитр. Держите клетки в тепле, держа трубку в одной руке при транспортировке на рыбный объект. Используя пластиковую пипетку, поместите эмбрионы зебры на инъекционной пластине.
Положите эмбрионы по бокам с передней облицовкой вперед выровнены с канавками на пластине. Включите источник воздуха и микроинжектор. После извлечения клеток HeLa из инкубатора, пипетка клетки вверх и вниз от 20 до 30 раз с помощью P200.
Используя наконечник загрузки геля с разрезанным концом, немедленно загрузите три микролитров подвески клетки HeLa в одну из игл для инъекций. Вставьте иглу в держатель иглы и поместите инъекционной пластины под микроскопом. Введите клеточную смесь в эмбрион в васкуляризированной области под полостью перивителина, нажав на педаль стопы.
Затем пипетка несколько капель стерильной рыбной воды на эмбрион. Чтобы продолжить процесс инъекций, используйте не доминирующую руку, чтобы переместить инъекционной пластины к следующему эмбриону, а затем использовать доминирующую руку, чтобы расширить и втянуть инжектор при одновременном нажатии педали ноги. Закончите инъекцию всех эмбрионов на тарелку и вымойте эмбрионы стерильной рыбной водой в стерильную чашку Петри.
Сразу же инкубировать блюдо при 35,5 градусах по Цельсию. Через три часа осмотрим вводимые эмбрионы и удалим мертвые. На следующий день сделайте инъекционные иглы для наночастиц и храните их на складе в большой чашке Петри.
Работая под флуоресцентным микроскопом, тщательно подбирайте эмбрионы с метастазами хвоста и посвячивайте их на новую инъекционной пластину со стерильной рыбной водой. Для каждой зебры с метастазами хвоста, вводить либо наночастицы раствора или воды за глазом. Также вводят раствор наночастиц за глазами зебры в контрольной группе, которая не получила пересадки HeLa и инкубировать все вводимые эмбрионы при 35,5 градусах по Цельсию.
Сразу же после инъекции и снова с интервалом от 30 до 60 минут, перенести два-три эмбриона в чашку Петри и обездвижить их, добавив пять капель разбавленного раствора MS222. Как только эмбрионы перестанут плавать, удалите большую часть воды, чтобы позволить эмбрионам лежать на боку. Используя пипетку с тонкой мягкой кистью, прикрепленной к ее концу, выровнять эмбрионы, чтобы они лежали с передней облицовкой вперед и только один глаз виден.
Используя 2X-увеличение, захватывайте изображения всего эмбриона на красных, синих и брайтфилдных каналах. Чтобы захватить область хвоста, изображение эмбрионов на 6.4X увеличение. Сосредоточьте эмбрион под красным каналом, чтобы избежать кровотечения наночастиц.
Сразу после визуализации добавьте пресную рыбную воду в эмбрионы и верните их в инкубатор. Инъекционные и контроль эмбрионов зебры были изображены с помощью флуоресцентного микроскопа. Красные точки являются метастатическими раковыми клетками шейки матки человека, в то время как синие точки представляют собой наночастицы.
В одной контрольной группе, зебрафиш, которые были введены с раковыми клетками, но не наночастицы, флуоресцентные клетки HeLa были видны в красном канале и никаких конкретных флуоресцентных сигналов были обнаружены в синем канале. В другой контрольной группе зебрафишам вводили наночастицы, но не раковые клетки. Голубые флуоресцентные наночастицы были распределены по всей системе кровообращения.
Никаких конкретных красных флоресок не было видно. Когда зебрафиш с метастазами хвоста вводили наночастицы, наложенные изображения из красных и синих каналов показывают ко-локализацию клеток HeLa и наночастиц. После выполнения этого метода, мы можем проанализировать бремя опухоли и выживаемость раковых клеток, животных с и без инъекций наночастиц, чтобы скорректировать их способность убивать раковые клетки.
Этот метод может облегчить выбор оптимальной наночастицы, которые могут конкретно распознавать раковые клетки in vivo, что приводит к раннему выявлению рака и метастазов рака.
