Bu prosedür, araştırmacıların büyük hayvanlarda ve klinik çalışmalarda yapılan çalışmalar için en uygun nano parçacıkları değerlendirmelerine ve seçmelerine olanak tanır. Bu basit yöntem nanopartikül ün vivo insan kanser hücrelerini hedef olup olmadığını ve eğer öyleyse, ne kadar etkili hedefleme belirlemeye yardımcı olur. Prosedürleri gösteren Dr.Xiodan Qin, bir postdoc, ve Bay Andrew Lam, bizim laboratuvardan bir araştırma teknisyeni olacaktır.
Akşam ları iki oda çiftleştirici tankı balık suyu ile doldurun ve üst tankları bölücüler kullanarak ayırın. Bir erkek zebra balığı odanın bir tarafına, bir veya iki dişi zebra balığı ise odanın başka bir tarafına yerleştirin. Bölücüleri ertesi sabah 08:00'de çıkarın.
Yapay zenginleştirme tesisleri ekleyin ve su sığ bir alan oluşturmak için biraz üst oda eğim. Zebra balığının üç ila dört saat üremesine izin verin ve bir örgü ağ üzerinden su dökerek alt odadan yumurta toplamak. Yumurtaları, her çan başına en fazla 200 yumurta içeren bir Petri kabına aktarın.
Herhangi bir ölü veya döllenmemiş yumurta çıkarın. Yemeğin üçte ikisini taze balık suyuyla doldurun ve kuvöze yerleştirin. 24 saat sonra, kuvözden çanak çıkarın ve çanak mümkün olduğunca çok su çıkarın.
Mililitre pronase çözeltisi başına bir miligram birkaç damla ekleyin ve yavaşça çanak girdap. Ne zaman korolar parçalanma belirtileri göstermek, pipet yukarı ve aşağı birkaç kez koroları yıkmak ve embriyoları serbest bırakmak için embriyolar. Embriyoların çoğunluğu korolar dışında bir kez, hemen süreci sona erdirmek için tatlı balık suyu ekleyin.
Yüzen koroları çıkarmak için embriyoları üç kez balık suyuyla durulayın embriyoları kuvöze geri döndürün. 100 mililitre otoklavbalık suyuna üç gram elektroforez sınıfı agarose ekleyerek %3 agarose çözeltisi yapın. Mikrodalga agarose ve su agarose tamamen çözülene kadar.
Enjeksiyon plakası oluşturmak için, üç çeyrek dolu olana kadar bir Petri kabına sıcak agarose çözeltisi dökün ve agarose üzerine mikro enjeksiyon kalıbı yerleştirin. Agarose katıldıktan sonra, dikkatlice kalıbı çıkarın. Otoklavlı balık suyu ile ortaya çıkan enjeksiyon plakası doldurun ve dört santigrat derece saklayın.
Enjeksiyon iğneleri yapmak için, bir pipet çekmece üzerinde 0,78 milimetre dış çapı borosilikat cam kılcal bir çekin. Enjeksiyon iğnelerini etanol havlusuyla silinmiş büyük bir Petri kabında macun üzerinde saklayın. HeLa hücrelerini toplamadan önce enjeksiyon plakasını ve balık suyunu kuvözdeki 35,5 santigrat derecede ısıtın.
Nakilden 30 dakika ila bir saat önce HeLa hücrelerini hasat edin. Bir doku kültürü başlık çalışma, aspirasyon ile şişeden orta kaldırın. Ortamın tüm izlerini gidermek için hücreleri steril PBS ile durula.
Şişeye üç mililitre steril tripsin EDTA ekleyin ve 37 santigrat derecede 3-5 dakika kuluçkaya yatırın. Enzimatik sindirim ilerlemesini izlemek için mikroskop altında şişe gözlemleyin. Hücrelerin yaklaşık% 80 askıya zaman, şişe ye büyüme orta altı ila sekiz mililitre ekleyin.
Hücreleri hafifçe boruhaline getirerek toplayın ve 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın. Tüpü 135 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve tam büyüme orta üç mililitre HeLa hücreleri resuspend.
Yıkama adımlarını iki kez tekrarladıktan sonra, hücreleri bir mililitrelik tam büyüme ortamında yeniden askıya alın. Sonra bir hemositometre kullanarak mikroskop altındaki hücreleri saymak. Hücreleri tekrar santrifüj ettikten sonra, supernatant çıkarın.
Mililitre başına yedinci hücrelere beş kez 10 konsantrasyonda 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp hücreleri resuspend. Balık tesisine taşırken tüpü bir elinde tutarak hücreleri sıcak tutun. Plastik bir pipet kullanarak, enjeksiyon plakası üzerine zebra balığı embriyoları yerleştirin.
Ön plaka üzerinde oluklar hizalanmış karşı karşıya ön ile yanlarında embriyolar lay. Hava kaynağını ve mikro enjektörü açın. Kuvözden HeLa hücrelerini aldıktan sonra, p200 kullanarak hücreleri 20-30 kez yukarı ve aşağı alın.
Bir kesme ucu ile bir jel yükleme ucu kullanarak, hemen enjeksiyon iğnelerinden birine HeLa hücre süspansiyon üç mikrolitre yükleyin. İğneyi iğne tutucuya takın ve enjeksiyon plakasını mikroskop altına yerleştirin. Ayak pedalına basarak perivitelline boşluğunun altındaki vaskülarize bölgede hücre karışımını embriyoya enjekte edin.
Sonra embriyo üzerine steril balık suyu birkaç damla pipet. Enjeksiyon işlemine devam etmek için, enjeksiyon plakasını bir sonraki embriyoya taşımak için baskın olmayan eli kullanın ve aynı anda ayak pedalına basarken enjektörü uzatmak ve geri çekmek için baskın eli kullanın. Tabakta tüm embriyoların enjeksiyonu bitirmek ve steril bir Petri çanak içine steril balık suyu ile embriyoları yıkayın.
Hemen 35,5 santigrat derece de çanak kuluçka. Üç saat sonra, enjekte edilen embriyoları inceleyin ve ölü olanları çıkarın. Ertesi gün, nano parçacıklar için enjeksiyon iğneleri yapmak ve büyük bir Petri çanak macun üzerinde saklayın.
Floresan mikroskop altında çalışarak, kuyruk metastazlı embriyoları dikkatlice toplayın ve steril balık suyu içeren yeni bir enjeksiyon tabağına yerleştirin. Kuyruk metastazı olan her zebra balığı için, gözün arkasına nano parçacık çözeltisi veya su enjekte edin. Ayrıca HeLa nakli almayan kontrol grubundaki zebra balığının gözlerinin arkasına nano parçacık solüsyonu enjekte edin ve enjekte edilen tüm embriyoları 35,5 santigrat dereceye kadar kuluçkaya yatırın.
Enjeksiyondan hemen sonra ve tekrar 30-60 dakikalık aralıklarla, bir Petri kabına iki ila üç embriyo aktarın ve seyreltilmiş MS222 çözeltisi beş damla ekleyerek onları hareketsiz hale getirin. Embriyolar yüzmeyi bıraktıktan sonra, embriyoların yanlarında yatmasını sağlamak için suyun çoğunu çıkarın. Sonuna bağlı ince yumuşak fırçalı bir pipet kullanarak, embriyoları ön tarafa bakan ve sadece bir gözü görünür olacak şekilde hizalayın.
2X büyütme kullanarak, kırmızı, mavi ve Brightfield kanallarında tüm embriyo görüntüleri yakalamak. Kuyruk alanını yakalamak için, embriyoları 6.4X büyütme de görüntüleyin. Nano parçacıkların kanamasını önlemek için kırmızı kanalın altında embriyo odaklanın.
Görüntülemeden hemen sonra, embriyolara taze balık suyu ekleyin ve onları kuvöze geri verin. Enjekte edilen ve kontrol zebra balığı embriyoları floresan mikroskop kullanılarak görüntülenmiştir. Kırmızı nokta metastatik insan servikal kanser hücreleri ise mavi nokta nano-parçacıkları temsil eder.
Bir kontrol grubunda, nano-parçacıklar ile enjekte edilen ancak nano parçacıklar ile enjekte edilen zebra balıkları, floresan HeLa hücreleri kırmızı kanalda görülebiliyordu ve mavi kanalda belirli floresan sinyaller saptanmadı. Diğer kontrol grubunda, zebra balıkları nano parçacıklar enjekte edildi, ama kanser hücreleri ile değil. Mavi floresan nano parçacıklar dolaşım sistemi boyunca dağıtıldı.
Belirli bir kırmızı floresans görünmüyordu. Kuyruk metastazlı zebra balıklarına nano parçacıklar enjekte edildiğinde, kırmızı ve mavi kanallardan gelen kaplanmış görüntüler HeLa hücreleri ve nano parçacıkların birlikte lokalizasyonunu gösterir. Bu yöntemi yaptıktan sonra, biz tümör yükü ve kanser hücresi sağkalım analiz edebilirsiniz, ve nano parçacıklar enjekte etmeden kanser hücrelerini öldürme yeteneklerini ayarlamak için.
Bu teknik özellikle kanser ve kanser metastazı erken teşhisine yol açan vivo kanser hücresi tanıyabilir optimal nanopartikül seçimi kolaylaştırabilir.
