הליך זה מאפשר לחוקרים להעריך ולבחור ננו-חלקיקים אופטימליים למחקרים בבעלי חיים גדולים ובניסויים קליניים. שיטה פשוטה זו מסייעת לקבוע אם הננו-חלקיק יכול למקד את התאים הסרטניים האנושיים ב- vivo ואם כן, עד כמה יעיל המיקוד. הדגמת ההליכים תהיה ד"ר שיודאן קין, פוסט-דוק, ומר אנדרו לאם, טכנאי מחקר מהמעבדה שלנו.
ממלאים שני מיכלי הזדווגות קאמריים במים דגים בערב ומפרידים בין המיכלים העליונים באמצעות מחיצות. מניחים דג זברה זכר בצד אחד של התא ונקבה אחת או שתיים זברה-דג לצד אחר של התא. הסר את המפרידים בשעה 8:00 בבוקר שלמחרת.
מוסיפים צמחי העשרה מלאכותיים ומטה מעט את התא העליון כדי ליצור אזור רדוד של מים. אפשר דג הזברה להתרבות במשך שלוש עד ארבע שעות ולאסוף את הביצים מהתא התחתון על ידי שפיכת המים דרך רשת רשת. מעבירים את הביצים לצלחת פטרי עם לא יותר מ -200 ביצים למנה.
הסר ביצים מתות או לא מופרות. ממלאים את המנה שני שליש מלא עם מי דגים טריים, ומ מניחים אותו באינקובטור. לאחר 24 שעות, מוציאים את המנה מהחממה ומסירים כמה שיותר מים מהצלחת.
מוסיפים כמה טיפות של מיליגרם אחד לכל פתרון פרונס מיליליטר בעדינות מערבולת את המנה. כאשר chorions להראות סימנים של התפוררות, פיפטה העוברים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לשבור את chorions ולשחרר את העוברים. לאחר שרוב העוברים הם מתוך chorions, מיד להוסיף מי דגים טריים כדי לסיים את התהליך.
שוטפים את העוברים במים דגים שלוש פעמים כדי להסיר את הצ'וריות הצפות מחזירים את העוברים לאנקובטור. הפוך פתרון 3%agarose על ידי הוספת שלושה גרם של אלקטרופורזה כיתה agarose ל 100 מיליליטר של מי דגים autoclaved. יש לחמם במיקרוגל את ההתעוררות והמים עד להמסה מוחלטת של ההתעוררות.
כדי ליצור את צלחת ההזרקה, יוצקים תסכום אגרוז חם לתוך צלחת פטרי עד שהוא שלושה רבעים מלא מניחים את עובש הזרקת מיקרו על אגרוז. לאחר שהתעוררות התגבשה, הסר בזהירות את התבנית. מלאו את צלחת ההזרקה שנוצרה במים של דגים אוטוקלאבים ואחסנו אותה בארבע מעלות צלזיוס.
כדי להפוך את מחטי ההזרקה, למשוך נימי זכוכית borosilicate קוטר חיצוני מילימטר אחד על ידי 0.78 מילימטרים על מושך פיפטה. לאחסן את מחטי ההזרקה על putty בצלחת פטרי גדולה כי כבר ניגב עם מגבת אתנול. לפני קצירת תאי הלה, מחממים מחדש את צלחת ההזרקה ומי הדגים באינקובטור ב-35.5 מעלות צלזיוס.
30 דקות עד שעה לפני ההשתלה, לקצור את תאי הלה. עבודה במכסה המנוע של תרבות הרקמה, להסיר את המדיום מן הבקבוק על ידי שאיפה. לשטוף את התאים עם PBS סטרילי כדי להסיר את כל העקבות של המדיום.
מוסיפים שלושה מיליליטר של טריפסין סטרילי EDTA לבקבוקון ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. שימו לב לבקבוקון מתחת למיקרוסקופ כדי לעקוב אחר התקדמות העיכול האנזימטי. כאשר כ 80% מהתאים מושעים, להוסיף שישה עד שמונה מיליליטר של מדיום צמיחה לבקבוקון.
לאסוף את התאים על ידי צינורות בעדינות ולהעביר אותם צינור סטרילי 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 135 פעמים G במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי והתן מחדש את תאי הלה בשלושה מיליליטר של מדיום צמיחה מלא.
לאחר חזרה על צעדי שטיפה פעמיים, resuspend התאים במיליליטר אחד של מדיום צמיחה מלאה. ואז לספור את התאים מתחת למיקרוסקופ באמצעות hemocytometer. לאחר צנטריפוגה של התאים שוב, להסיר את העל-טבעי.
תחוו מחדש את התאים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר בריכוז של פי 5 מ-10 לתאים השביעיים למיליליטר. שמור על התאים חמים על ידי החזקת הצינור ביד אחת בעת הובלה למתקן הדגים. בעזרת פיפטה מפלסטיק, מניחים את עוברי הזברה על צלחת ההזרקה.
הניחו עוברים על צידיהם כשהקדום פונה קדימה מיושר לחריצים על הצלחת. הפעל את מקור האוויר ואת מזרק המיקרו. לאחר אחזור תאי הלה מהאינקובטור, פיפטה התאים למעלה ולמטה 20 עד 30 פעמים באמצעות P200.
באמצעות קצה טעינת ג'ל עם קצה לחתוך, מיד לטעון שלושה microliters של ההשעיה תא HeLa לתוך אחד מחטי ההזרקה. הכנס את המחט למחזיק המחט והצב את לוחית ההזרקה מתחת למיקרוסקופ. להזריק את תערובת התא לתוך העובר באזור כלי הדם מתחת לחלל perivitelline על ידי לחיצה על דוושת הרגל.
ואז פיפטה כמה טיפות של מי דגים סטריליים על העובר. כדי להמשיך בתהליך ההזרקה, השתמש ביד הלא דומיננטית כדי להזיז את צלחת ההזרקה לעובר הבא, ולאחר מכן השתמש ביד הדומיננטית כדי להאריך ולמשוך את המזרק תוך כדי לחיצה בו זמנית על דוושת הרגל. לסיים את הזרקת כל העוברים על הצלחת ולשטוף את העוברים עם מי דגים סטריליים לתוך צלחת פטרי סטרילית.
מיד להחגירה את המנה ב 35.5 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש שעות, לבדוק את העוברים מוזרק ולהסיר את המתים. ביום שלמחר, לעשות מחטי הזרקה עבור חלקיקי ננו ולאחסן אותם על putty בצלחת פטרי גדולה.
עובדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אוספים בזהירות עוברים עם גרורות זנב ומ מניחים אותם על צלחת הזרקה חדשה עם מי דגים סטריליים. עבור כל דג זברה עם גרורות זנב, להזריק גם פתרון חלקיקי ננו או מים מאחורי העין. גם להזריק פתרון חלקיקי ננו מאחורי העיניים של דג הזברה בקבוצת הביקורת אשר לא קיבלו השתלות HeLa הדגירה כל העוברים מוזרק ב 35.5 מעלות צלזיוס.
מיד לאחר ההזרקה ושוב במרווחים של 30 עד 60 דקות, מעבירים שניים עד שלושה עוברים לצלחת פטרי ומשתקים אותם על ידי הוספת חמש טיפות של פתרון MS222 מדולל. לאחר שהעוברים מפסיקים לשחות, מוציאים את רוב המים כדי לאפשר לעוברים לשכב על צידם. באמצעות פיפטה עם מברשת רכה דקה המחוברת לקצה שלה, ליישר את העוברים כך שהם שוכבים עם הקדמי פונה קדימה ורק עין אחת גלויה.
באמצעות הגדלה פי 2, לכוד תמונות של העובר כולו בערוצים אדומים, כחולים וברייטפילד. כדי ללכוד את אזור הזנב, צלם את העוברים בהגדלה של פי 6.4. מקד את העובר מתחת לתעלה האדומה כדי למנוע דימום של ננו חלקיקים.
מיד לאחר ההדמיה, מוסיפים מי דגים טריים לעוברים ומחזירים אותם לחממה. עוברי זברה מוזרקים ושולטים דימוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנקודות האדומות הן תאים גרורתיים של סרטן צוואר הרחם האנושי בעוד הנקודות הכחולות מייצגות את הננו-חלקיקים.
בקבוצת ביקורת אחת, דגי זברה שהוזרקו לתאים סרטניים אך לא ננו-חלקיקים, נראו בתאי HeLa פלואורסצנטיים בתעלה האדומה ולא אותרו אותות פלואורסצנטיים ספציפיים בתעלה הכחולה. בקבוצת הביקורת השנייה, דגי זברה הוזרקו עם ננו חלקיקים, אבל לא עם תאים סרטניים. ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים כחולים הופצו בכל מערכת הדם.
שום פלורציה אדומה ספציפית לא נראתה לעין. כאשר דגי זברה עם גרורות זנב הוזרקו עם ננו חלקיקים, תמונות מכוסות מהערוצים האדומים והכחולים מראות לוקליזציה של תאי HeLa וננו-חלקיקים. לאחר ביצוע שיטה זו, אנו יכולים לנתח את נטל הגידול והישרדות תאים סרטניים, בעלי החיים עם ובלי הזרקת ננו חלקיקים כדי להתאים את יכולתם להרוג תאים סרטניים.
טכניקה זו עשויה להקל על הבחירה של חלקיק אופטימלי שיכול לזהות במיוחד את התא הסרטני ב vivo המוביל לגילוי מוקדם של סרטן וסרטן גרורות.
