Questa procedura consente ai ricercatori di valutare e selezionare nanoparticelle ottimali per studi su animali di grandi dimensioni e studi clinici. Questo semplice metodo aiuta a determinare se la nanoparticella può colpire le cellule tumorali umane in vivo e, in tal caso, quanto è efficiente il targeting. A dimostrare le procedure saranno il Dr.Xiodan Qin, un postdoc, e il Signor Andrew Lam, un tecnico di ricerca del nostro laboratorio.
Riempire due vasche di accoppiamento a camera con acqua di pesce la sera e separare i serbatoi superiori utilizzando divisori. Posizionare un pesce zebra maschio in un lato della camera e una o due femmine di zebrafish in un altro lato della camera. Rimuovere i divisori alle 8:00 del mattino seguente.
Aggiungere piante di arricchimento artificiali e inclinare leggermente la camera superiore per creare un'area d'acqua poco profonda. Lasciare che il pesce zebra si riprodu per tre o quattro ore e raccogliere le uova dalla camera inferiore versando l'acqua attraverso una rete a rete. Trasferire le uova in una piastra di Petri con non più di 200 uova per piatto.
Rimuovere eventuali uova morte o non fecondate. Riempire il piatto due terzi pieno di acqua di pesce fresco e posizionare nell'incubatrice. Dopo 24 ore, rimuovere il piatto dall'incubatrice e rimuovere quanta più acqua possibile dal piatto.
Aggiungere alcune gocce di un milligrammo per millilitro pronasi soluzione e ruotare delicatamente il piatto. Quando i corrioni mostrano segni di disintegrazione, pipettare gli embrioni su e giù alcune volte per abbattere i coriorioni e rilasciare gli embrioni. Una volta che la maggior parte degli embrioni è fuori dai corioni, aggiungere immediatamente acqua di pesce fresco per terminare il processo.
Risciacquare gli embrioni con acqua di pesce tre volte per rimuovere i coriaci galleggianti Restituire gli embrioni all'incubatrice. Crea una soluzione di agarosio al 3% aggiungendo tre grammi di agarosio di grado elettroforesi a 100 millilitri di acqua di pesce autoclavata. Microonde l'agarosio e l'acqua fino a quando l'agarosio è completamente sciolto.
Per creare la piastra di iniezione, versare la soluzione di agarosio caldo in una piastra di Petri fino a quando non è piena di tre quarti e posizionare lo stampo a micro iniezione sull'agarosio. Dopo che l'agarosio si è solidificato, rimuovere con cura lo stampo. Riempire la piastra di iniezione risultante con acqua di pesce autoclavata e conservarla a quattro gradi Celsius.
Per realizzare gli aghi di iniezione, tirare i capillari di vetro borosilicato di un millimetro di diametro esterno di 0,78 millimetri su un estrattore di pipetta. Conservare gli aghi di iniezione su uno stito in una grande piastra di Petri che è stata asciugata con un asciugamano di etanolo. Prima di raccogliere le cellule HeLa, riventare la piastra di iniezione e l'acqua di pesce nell'incubatrice a 35,5 gradi Celsius.
30 minuti a un'ora prima del trapianto, raccogliere le cellule HeLa. Lavorando in una cappa di coltura tissutale, rimuovere il mezzo dal pallone per aspirazione. Risciacquare le cellule con PBS sterile per rimuovere tutte le tracce del mezzo.
Aggiungere tre millilitri di EDTA sterile di tripina al pallone e incubarlo a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti. Osservare il pallone al microscopio per monitorare l'avanzamento della digestione enzimatica. Quando circa l'80% delle cellule è sospeso, aggiungere da sei a otto millilitri di mezzo di crescita al pallone.
Raccogliere le cellule tubazioni delicatamente e trasferirle in un tubo sterile da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 135 volte G per cinque minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule HeLa in tre millilitri di mezzo di crescita completo.
Dopo aver ripetuto due volte i passaggi di lavaggio, rimorsi le cellule in un millilitro di mezzo di crescita completo. Quindi contare le cellule al microscopio usando un emocitometro. Dopo aver centrifugato di nuovo le cellule, rimuovere il supernatante.
Rimescolare le cellule in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri ad una concentrazione di cinque volte 10 alla settima cellule per millilitro. Mantenere le celle calde tenendo il tubo in una mano durante il trasporto verso l'impianto di pesca. Utilizzando una pipetta di plastica, posizionare gli embrioni di zebrafish sulla piastra di iniezione.
Posare gli embrioni sui loro lati con la parte anteriore rivolta in avanti allineata alle scanalature sul piatto. Accendere la fonte d'aria e il micro iniettore. Dopo aver recuperato le cellule HeLa dall'incubatore, pipettare le cellule su e giù da 20 a 30 volte usando un P200.
Utilizzando una punta di caricamento del gel con un'estremità tagliata, caricare immediatamente tre microlitri della sospensione cellulare HeLa in uno degli aghi di iniezione. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e posizionare la piastra di iniezione al microscopio. Iniettare la miscela cellulare nell'embrione nell'area vascolarizzata sotto la cavità perivitellina premendo il pedale del piede.
Quindi pipettare alcune gocce di acqua di pesce sterile sull'embrione. Per continuare il processo di iniezione, utilizzare la mano non dominante per spostare la piastra di iniezione sull'embrione successivo, quindi utilizzare la mano dominante per estendere e ritrarre l'iniettore premendo contemporaneamente il pedale del piede. Termina l'iniezione di tutti gli embrioni sul piatto e lava gli embrioni con acqua di pesce sterile in una piastra di Petri sterile.
Incubare immediatamente il piatto a 35,5 gradi Celsius. Dopo tre ore, esaminare gli embrioni iniettati e rimuovere quelli morti. Il giorno dopo, fai aghi di iniezione per le nanoparticelle e conservali su uno putty in una grande piastra di Petri.
Lavorando al microscopio fluorescente, raccogli attentamente gli embrioni con metastasi della coda e posizionali su una nuova piastra di iniezione con acqua di pesce sterile. Per ogni zebrafish con metastasi della coda, iniettare soluzione di nanoparticelle o acqua dietro l'occhio. Iniettare anche una soluzione di nanoparticelle dietro gli occhi del pesce zebra nel gruppo di controllo che non ha ricevuto trapianti di HeLa e incubare tutti gli embrioni iniettati a 35,5 gradi Celsius.
Immediatamente dopo l'iniezione e di nuovo a intervalli da 30 a 60 minuti, trasferire da due a tre embrioni in una piastra di Petri e immobilizzarli aggiungendo cinque gocce di soluzione MS222 diluita. Una volta che gli embrioni smettono di nuotare, rimuovere la maggior parte dell'acqua per consentire agli embrioni di sdraiarsi sui loro lati. Utilizzando una pipetta con un sottile pennello morbido attaccato alla sua estremità, allineare gli embrioni in modo che giacciono con la parte anteriore rivolta in avanti e solo un occhio visibile.
Utilizzando l'ingrandimento 2X, cattura le immagini dell'intero embrione sui canali rosso, blu e Brightfield. Per catturare l'area della coda, immagini gli embrioni con ingrandimento 6.4X. Focalizzare l'embrione sotto il canale rosso per evitare il sanguinamento delle nanoparticelle.
Immediatamente dopo l'imaging, aggiungere acqua di pesce fresco agli embrioni e restituirli all'incubatrice. Gli embrioni zebrafish iniettati e di controllo sono stati coniati utilizzando un microscopio fluorescente. I punti rossi sono cellule tumorali cervicali umane metastatiche mentre i punti blu rappresentano le nanoparticelle.
In un gruppo di controllo, i pesci zebra che sono stati iniettati con cellule tumorali ma non nanoparticelle, le cellule HeLa fluorescenti erano visibili nel canale rosso e non sono stati rilevati segnali fluorescenti specifici nel canale blu. Nell'altro gruppo di controllo, ai pesci zebra sono state iniettate nanoparticelle, ma non con cellule tumorali. Le nanoparticelle fluorescenti blu sono state distribuite in tutto il sistema circolatorio.
Nessuna florescence rossa specifica era visibile. Quando i pesci zebra con metastasi della coda sono stati iniettati con nanoparticelle, le immagini sovrapposte dai canali rosso e blu mostrano la co-localizzazione delle cellule HeLa e delle nanoparticelle. Dopo aver eseguito questo metodo, possiamo analizzare il peso del tumore e la sopravvivenza delle cellule tumorali, gli animali con e senza iniettare nanoparticelle per regolare la loro capacità di uccidere le cellule tumorali.
Questa tecnica può facilitare la selezione della nanoparticella ottimale in grado di riconoscere specificamente la cellula tumorale in vivo portando alla diagnosi precoce di cancro e metastasi tumorale.
