توفر هذه الطريقة إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية توليد عضويات معوية مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات يسببها الإنسان عن طريق التمايز إلى الأديم الباطن النهائي ، ثم ظهارة الأمعاء الخلفية ، وأخيرا ، النقل إلى ظروف ثقافة 3D. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها من الكائنات العضوية المعوية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان قابلية ترجمة أكبر من البيانات من الثقافات أحادية الخلية ، في حين أنها أيضا أكثر عملية من الكائنات العضوية المشتقة من الأنسجة الأولية ، والتي قد يكون من الصعب الاحتفاظ بها في الثقافة على المدى الطويل. عند توليد الخلايا المعوية البشرية من iPSCs المتمايزة ، استخدم ماصة مصلية 5 ملليلتر لفصل الطبقة الأحادية للخلية عن كل بئر من اللوحة المكونة من 6 آبار.
وتجميع الخلايا في أنبوب واحد سعة 15 ملليلتر للطرد المركزي. إعادة تعليق بيليه في وسط النمو المعوي تستكمل مع عوامل النمو. وأضف الحجم المناسب من المصفوفة خارج الخلية وفقا لعدد الآبار التي يتم طلائها.
أضف 30 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى مركز العدد المناسب من الآبار للوحة 48 بئرا. يعد ضمان وضع ECM في وسط البئر أمرا مهما للغاية لاستقرار تلك العينة على المدى الطويل. إذا لامست وحدة التحكم الإلكترونية جدار البئر ، فقد تنهار ويمكن فقد العينات.
ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 5 دقائق على الأقل. عندما يتم ضبط المصفوفة خارج الخلية ، أضف 300 ميكرولتر من وسط نمو الأمعاء الطازج المكمل بعوامل النمو إلى كل بئر ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد 48 ساعة ، استخدم مجهرا ضوئيا لفحص الآبار بحثا عن تكوين عضوي.
بعد 7 أيام من الثقافة ، استنشق وسائط الثقافة واستبدلها ب DPBS بارد الجليد. استخدم ماصة مصلية 5 ملليلتر لفصل المواد العضوية وكرة المصفوفة خارج الخلية ميكانيكيا عن اللوحة. بعد ذلك ، قم بتجميع المواد العضوية في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 15 ملليلتر.
اجمع المواد العضوية عن طريق الطرد المركزي ونضح المادة الطافية وصولا إلى أعلى طبقة ECM المرئية. أعد تعليق الحبيبات في 15 ملليلتر من الثلج البارد DPBS وأجهزة الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى. بعد استنشاق المادة الطافية كما هو موضح ، أعد تعليق الحبيبات في 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد واستخدم ماصة P200 لتعطيل المواد العضوية السليمة يدويا.
تأكيد التفكك الكامل للعضويات. قم بتدوير المواد العضوية المنفصلة وإعادة تعليقها في الحجم المطلوب من المصفوفة خارج الخلية قبل الطلاء على لوحة جديدة من 48 بئرا ، كما هو موضح. ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق.
بعد 5 دقائق ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وإضافة الوسائط القاعدية المعوية مع عوامل النمو ومثبطات ROCK. تغيير الوسائط كل 2-4 أيام. لتحفيز استجابة التهابية في الكائنات العضوية المعوية ، استبدل المادة الطافية في كل بئر من الثقافة العضوية ب 300 ميكرولتر من الوسط القاعدي الطازج المكمل ب 40 نانوجرام لكل ملليلتر من TNF alpha.
ثم أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة لتكرار بيئة مؤيدة للالتهابات. يمكن مراقبة التعبير الجيني على مدار تمايز IPSC البشري باستخدام علامات تعدد القدرات التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في اليوم 0 ويتم تنظيمها بسرعة أثناء عملية تمايز الأديم الباطن النهائي. في اليوم 2 من التمايز ، يجب أن يبدأ التعبير عن جينات الأديم الباطن النهائية ، ويجب أن يصل التعبير إلى ذروته في اليوم 3.
أثناء مواصفات القناة الهضمية الخلفية ، يجب تحفيز تعبير CDX2 و HNF4alpha وزيادته بمرور الوقت. بعد 48 ساعة من نقل ورقة الخلية 2D ، يجب أن تبدأ أوراق الخلايا في التنظيم التلقائي في هياكل كروية 3D أكثر ضغطا تكون صغيرة في البداية ، ولكنها تزداد تدريجيا في الحجم والتعقيد خلال الأيام 7-10 القادمة من الثقافة. لا ينبغي تمرير الكائنات العضوية حتى تحقق مورفولوجيا كروية عضوية واضحة مع ظهارة واضحة ومع توجيه التجويف نحو مركز الهيكل.
عندما تصل الهياكل إلى هذه المرحلة ، يمكن إجراء الكيمياء المناعية لتأكيد التعبير عن علامات الأمعاء ، مثل villin و CDX2. لنمذجة الالتهاب ، يمكن إضافة TNF alpha إلى وسط زراعة الأنسجة لمدة 24-48 ساعة ، مما يؤدي عادة إلى التعبير عن علامات مؤيدة للالتهابات بالتزامن مع تقليل تنظيم العلامات الظهارية المعوية. يمكن استخدام العضويات المعوية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان لاكتشاف الأدوية ، ونمذجة الأمراض ، وتحرير الجينات ، ودراسة البيئة المكروية للورم ، والملف النسخي والبروتيني ، واللاجيني لأي مرض مهم.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة العديد من المختبرات في إنشاء عضويات معوية كنظام نموذجي ، مما يوفر لهم طريقة إضافية لأبحاثهم.
