Cette méthode fournit des instructions étape par étape sur la façon de générer des organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme par différenciation en endoderme définitif, puis en épithélium intestinal postérieur et, enfin, en transfert dans des conditions de culture 3D. Les résultats obtenus à partir d’organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme démontrent une plus grande traduisibilité que les données provenant de cultures monocellulaires, tout en étant plus pratiques que les organoïdes primaires dérivés de tissus, qui peuvent être difficiles à conserver en culture à long terme. Lors de la génération de cellules intestinales humaines à partir de cellules iPS différenciées, utilisez une pipette sérologique de 5 millilitres pour détacher la monocouche cellulaire de chaque puits de la plaque à 6 puits.
Et regroupez les cellules dans un seul tube de 15 millilitres pour la centrifugation. Remettre la granule en suspension dans un milieu de croissance intestinal complété par des facteurs de croissance. Et ajoutez le volume approprié de matrice extracellulaire en fonction du nombre de puits à plaquer.
Ajouter 30 microlitres de la suspension cellulaire au centre du nombre approprié de puits d’une plaque à 48 puits. Il est très important de s’assurer que l’ECM est placé au centre du puits pour assurer la stabilité à long terme de cet échantillon. Si l’ECM touche la paroi du puits, il peut s’effondrer et les échantillons peuvent être perdus.
Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au moins 5 minutes. Lorsque la matrice extracellulaire a pris, ajoutez 300 microlitres de milieu de croissance intestinal frais complété par des facteurs de croissance dans chaque puits, et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 48 heures, utilisez un microscope optique pour vérifier la formation d’organoïdes dans les puits.
Après 7 jours de culture, aspirez le milieu de culture et remplacez-le par du DPBS glacé. Utilisez une pipette sérologique de 5 millilitres pour détacher mécaniquement les organoïdes et la sphère de la matrice extracellulaire de la plaque. Ensuite, regroupez les organoïdes dans un seul tube à centrifuger de 15 millilitres.
Recueillir les organoïdes par centrifugation et aspirer le surnageant jusqu’au sommet de la couche ECM visible. Mettez à nouveau la pastille en suspension dans 15 millilitres de DPBS glacé et centrifugez à nouveau les cellules. Après avoir aspiré le surnageant comme démontré, remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de PBS glacé et utiliser une pipette P200 pour perturber manuellement les organoïdes intacts.
Confirmer une dissociation complète des organoïdes. Faire tourner les organoïdes dissociés et les remettre en suspension dans le volume requis de la matrice extracellulaire avant de les plaquer sur une nouvelle plaque à 48 puits, comme démontré. Ensuite, remettez l’assiette dans l’incubateur pendant 5 minutes.
Après 5 minutes, retirez la plaque de l’incubateur et ajoutez le milieu basal intestinal avec les facteurs de croissance et l’inhibiteur ROCK. Changez de support tous les 2 à 4 jours. Pour déclencher une réponse inflammatoire dans les organoïdes intestinaux, remplacez le surnageant dans chaque puits de la culture organoïde par 300 microlitres de milieu basal fraîchement préparé complété par 40 nanogrammes par millilitre de TNF alpha.
Ensuite, remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures pour reproduire un environnement pro-inflammatoire. L’expression des gènes peut être surveillée au cours de la différenciation IPSC humaine à l’aide de marqueurs de pluripotence qui sont fortement exprimés au jour 0 et qui sont rapidement régulés à la baisse pendant le processus de différenciation définitive de l’endoderme. Au jour 2 de la différenciation, les gènes définitifs de l’endoderme devraient commencer à être exprimés, et l’expression devrait culminer au jour 3.
Au cours de la spécification de l’intestin postérieur, l’expression de CDX2 et HNF4alpha doit être induite et augmenter avec le temps. 48 heures après le transfert de la feuille cellulaire 2D, les feuilles de cellules devraient commencer à s’auto-organiser en structures sphéroïdes 3D plus compactes qui sont initialement petites, mais qui augmentent progressivement en taille et en complexité au cours des 7 à 10 jours suivants de culture. Les organoïdes ne doivent pas être passés tant qu’ils n’ont pas atteint une morphologie sphéroïde organoïde claire avec un épithélium évident et avec la lumière orientée vers le centre de la structure.
Lorsque les structures atteignent ce stade, l’immunocytochimie peut être réalisée pour confirmer l’expression de marqueurs intestinaux, tels que la villine et la CDX2. Pour modéliser l’inflammation, le TNF alpha peut être ajouté au milieu de culture tissulaire pendant 24 à 48 heures, ce qui entraîne généralement l’expression de marqueurs pro-inflammatoires en conjonction avec la régulation négative des marqueurs épithéliaux intestinaux. Les organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme peuvent être utilisés pour la découverte de médicaments, la modélisation de maladies, l’édition de gènes, l’étude du microenvironnement tumoral, le profil transcriptomique et protéomique et épigénétique de toute maladie d’intérêt.
Cette méthode peut aider de nombreux laboratoires à établir des organoïdes intestinaux en tant que système modèle, leur fournissant une méthode supplémentaire pour leurs recherches.
