이 방법은 최종 내배엽, 뒷장 상피로 분화한 다음 3D 배양 조건으로 전환하여 인간 유도 만능 줄기세포 유래 장 오가노이드를 생성하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 인간 유도 만능 줄기세포 유래 장 오가노이드에서 얻은 결과는 단세포 배양 데이터보다 더 큰 번역 가능성을 보여주며, 배양에 장기간 보관하기 어려울 수 있는 일차 조직 유래 오가노이드보다 더 실용적입니다. 분화된 iPSC에서 인간 장 세포를 생성할 때 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 6웰 플레이트의 각 웰에서 세포 단층을 분리합니다.
그리고 원심분리를 위해 단일 15밀리리터 튜브에 세포를 모읍니다. 성장 인자가 보충된 장 성장 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그리고 도금되는 웰의 수에 따라 적절한 부피의 세포외 기질을 추가합니다.
30 마이크로리터의 셀 현탁액을 48웰 플레이트의 적절한 수의 웰 중앙에 추가합니다. ECM이 웰 중앙에 배치되도록 하는 것은 해당 샘플의 장기적인 안정성에 매우 중요합니다. ECM이 우물 벽에 닿으면 우물이 무너지고 샘플이 손실될 수 있습니다.
플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 최소 5분 동안 놓습니다. 세포외 기질이 굳으면 성장 인자가 보충된 신선한 장 성장 배지 300마이크로리터를 각 웰에 추가하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 48시간 후 광학 현미경을 사용하여 웰의 오가노이드 형성을 확인합니다.
7일 배양 후 배양 배지를 흡인하고 얼음처럼 차가운 DPBS로 교체합니다. 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 플레이트에서 오가노이드와 세포외 기질 구체를 기계적으로 분리합니다. 그런 다음 오가노이드를 단일 15mL 원심분리기 튜브에 모읍니다.
원심분리를 통해 오가노이드를 수집하고 상층액을 가시 ECM 층의 상단까지 흡인합니다. 펠릿을 얼음처럼 차가운 DPBS 15밀리리터에 다시 현탁시키고 세포를 다시 원심분리합니다. 시연된 대로 상층액을 흡입한 후 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS 1mL에 다시 현탁시키고 P200 피펫을 사용하여 온전한 오가노이드를 수동으로 파괴합니다.
오가노이드의 완전한 해리를 확인합니다. 해리된 오가노이드를 회전시키고 세포외 기질의 필요한 부피에 다시 현탁시킨 후 시연된 대로 새로운 48웰 플레이트에 도금합니다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터에 5분 동안 다시 넣습니다.
5분 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장 인자와 ROCK 억제제가 있는 장 기저 배지를 추가합니다. 2-4일마다 미디어를 교체하십시오. 장내 오가노이드에서 염증 반응을 유발하려면 오가노이드 배양의 각 웰에 있는 상층액을 TNF 알파 밀리리터당 40나노그램이 보충된 300마이크로리터의 갓 준비된 기초 배지로 대체합니다.
그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 48시간 동안 되돌려 염증 유발 환경을 재현합니다. 유전자 발현은 0일째에 고도로 발현되고 결정적인 내배엽 분화 과정에서 빠르게 하향 조절되는 만능 마커를 사용하여 인간 IPSC 분화 과정에서 모니터링할 수 있습니다. 분화 2일째에 최종 내배엽 유전자가 발현되기 시작하고 발현은 3일째에 최고조에 달해야 합니다.
뒷장 사양 동안 CDX2 및 HNF4alpha 발현이 유도되고 시간이 지남에 따라 증가해야 합니다. 2D 세포 시트 이식 후 48시간이 지나면 세포 시트가 처음에는 작지만 다음 7-10일 배양 동안 크기와 복잡성이 점차 증가하는 더 압축된 3D 스페로이드 구조로 자동 구성되기 시작해야 합니다. 오가노이드는 명백한 상피를 가진 명확한 오가노이드 스페로이드 형태를 달성하고 내강이 구조의 중심을 향할 때까지 통과해서는 안 됩니다.
구조가 이 단계에 도달하면 면역세포화학을 수행하여 villin 및 CDX2와 같은 장 마커의 발현을 확인할 수 있습니다. 염증을 모델링하기 위해 TNF 알파를 24-48시간 동안 조직 배양 배지에 첨가할 수 있으며, 이는 일반적으로 장 상피 마커의 하향 조절과 함께 전염증성 마커의 발현을 초래합니다. 인간 유도 만능 줄기세포 유래 장 오가노이드는 약물 발견, 질병 모델링, 유전자 편집, 종양 미세환경 연구, 관심 질환의 전사체 및 단백질체, 후성유전학적 프로파일에 사용할 수 있습니다.
이 방법은 많은 실험실에서 장 오가노이드를 모델 시스템으로 확립하는 데 도움이 될 수 있으며, 연구를 위한 추가 방법을 제공할 수 있습니다.
