Bu yöntem, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi bağırsak organoidlerinin kesin endoderme, ardından arka bağırsak epiteline ve son olarak 3D kültür koşullarına aktarılarak nasıl üretileceğine dair adım adım talimatlar sağlar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı bağırsak organoidlerinden elde edilen sonuçlar, tek hücreli kültürlerden elde edilen verilerden daha fazla çevrilebilirlik gösterirken, aynı zamanda kültürde uzun süre tutulması zor olabilen birincil doku kaynaklı organoidlerden daha pratiktir. Farklılaşmış iPSC'lerden insan bağırsak hücrelerinin üretilmesi üzerine, hücre tek tabakasını 6 oyuklu plakanın her bir oyuğundan ayırmak için 5 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.
Ve hücreleri santrifüjleme için 15 mililitrelik tek bir tüpte toplayın. Pelet, büyüme faktörleri ile desteklenmiş bağırsak büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Ve kaplanan kuyucuk sayısına göre uygun hacimde hücre dışı matris ekleyin.
48 oyuklu bir plakanın uygun sayıda oyuğunun ortasına 30 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. ECM'nin kuyunun ortasına yerleştirilmesini sağlamak, o numunenin uzun vadeli stabilitesi için çok önemlidir. ECM kuyu duvarına dokunursa çökebilir ve numuneler kaybolabilir.
Plakayı en az 5 dakika hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücre dışı matris ayarlandığında, her bir oyuğa büyüme faktörleri ile desteklenmiş 300 mikrolitre taze bağırsak büyüme ortamı ekleyin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. 48 saat sonra, oyuklarda organoid oluşumu olup olmadığını kontrol etmek için bir ışık mikroskobu kullanın.
7 günlük kültürden sonra, kültür ortamını aspire edin ve buz gibi DPBS ile değiştirin. Organoidleri ve hücre dışı matris küresini plakadan mekanik olarak ayırmak için 5 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Ardından, organoidleri tek bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne toplayın.
Organoidleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı görünür ECM tabakasının tepesine kadar aspire edin. Peletleri 15 mililitre buz gibi soğuk DPBS'de tekrar süspanse edin ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı gösterildiği gibi aspire ettikten sonra, peleti 1 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin ve bozulmamış organoidleri manuel olarak parçalamak için bir P200 pipeti kullanın.
Organoidlerin tamamen ayrıştığını onaylayın. Ayrışmış organoidleri döndürün ve gösterildiği gibi 48 oyuklu yeni bir plaka üzerine kaplamadan önce hücre dışı matrisin gerekli hacminde yeniden süspanse edin. Ardından, plakayı 5 dakika boyunca inkübatöre geri koyun.
5 dakika sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve büyüme faktörleri ve ROCK inhibitörü ile bağırsak bazal ortamını ekleyin. Medyayı 2-4 günde bir değiştirin. Bağırsak organoidlerinde enflamatuar bir yanıtı tetiklemek için, organoid kültürün her bir oyuğundaki süpernatanı, mililitre TNF alfa başına 40 nanogram ile takviye edilmiş 300 mikrolitre taze hazırlanmış bazal ortam ile değiştirin.
Daha sonra, pro-enflamatuar bir ortamı çoğaltmak için plakayı 48 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Gen ekspresyonu, 0. günde yüksek oranda eksprese edilen ve kesin endoderm farklılaşması sürecinde hızla aşağı regüle edilen pluripotens belirteçleri kullanılarak insan IPSC farklılaşması boyunca izlenebilir. Farklılaşmanın 2. gününde, kesin endoderm genleri eksprese edilmeye başlanmalı ve ekspresyon 3. günde zirve yapmalıdır.
Arka bağırsak spesifikasyonu sırasında, CDX2 ve HNF4alfa ekspresyonu indüklenmeli ve zamanla artmalıdır. 2D hücre tabakası transferinden 48 saat sonra, hücre tabakaları, başlangıçta küçük olan, ancak sonraki 7-10 günlük kültür boyunca boyut ve karmaşıklık açısından kademeli olarak artan daha sıkıştırılmış 3D küresel yapılar halinde otomatik olarak organize olmaya başlamalıdır. Organoidler, belirgin epiteli olan ve lümen yapının merkezine doğru bakacak şekilde net bir organoid küresel morfoloji elde edene kadar geçilmemelidir.
Yapılar bu aşamaya ulaştığında, villin ve CDX2 gibi bağırsak belirteçlerinin ekspresyonunu doğrulamak için immünositokimya yapılabilir. Enflamasyonu modellemek için, TNF alfa doku kültürü ortamına 24-48 saat boyunca eklenebilir, bu da tipik olarak bağırsak epitel belirteçlerinin aşağı regülasyonu ile birlikte pro-inflamatuar belirteçlerin ekspresyonu ile sonuçlanır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı bağırsak organoidleri, ilaç keşfi, hastalık modellemesi, gen düzenleme, tümör mikroçevresinin incelenmesi ve ilgilenilen herhangi bir hastalığın transkriptomik ve proteomik ve epigenetik profili için kullanılabilir.
Bu yöntem, birçok laboratuvarın bağırsak organoidlerini model bir sistem olarak oluşturmasına yardımcı olabilir ve onlara araştırmaları için ek bir yöntem sağlayabilir.
