Diese Methode bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darmorganoiden durch Differenzierung in definitives Endoderm, dann in Hinterdarmepithel und schließlich den Transfer in 3D-Kulturbedingungen. Die Ergebnisse von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm-Organoiden zeigen eine bessere Übertragbarkeit als Daten aus monozellulären Kulturen und sind gleichzeitig praktischer als aus dem Primärgewebe gewonnene Organoide, die sich nur schwer langfristig in Kultur halten lassen. Bei der Erzeugung menschlicher Darmzellen aus differenzierten iPS-Zellen wird eine serologische 5-Milliliter-Pipette verwendet, um die Zellmonoschicht von jeder Vertiefung der 6-Well-Platte zu lösen.
Und fassen Sie die Zellen in einem einzigen 15-Milliliter-Röhrchen für die Zentrifugation zusammen. Resuspendieren Sie das Pellet in Darmwachstumsmedium, ergänzt mit Wachstumsfaktoren. Und fügen Sie das entsprechende Volumen der extrazellulären Matrix entsprechend der Anzahl der Wells hinzu, die beschichtet werden.
Geben Sie 30 Mikroliter der Zellsuspension in die Mitte der entsprechenden Anzahl von Wells einer 48-Well-Platte. Die Sicherstellung, dass das ECM in der Mitte des Wells platziert wird, ist sehr wichtig für die Langzeitstabilität dieser Probe. Wenn das ECM die Wand des Wells berührt, kann es kollabieren und die Proben können verloren gehen.
Legen Sie die Platte für mindestens 5 Minuten in den Zellkultur-Inkubator. Wenn die extrazelluläre Matrix ausgehärtet ist, geben Sie 300 Mikroliter frisches Darmwachstumsmedium, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt ist, in jede Vertiefung und legen Sie die Platte zurück in den Zellkultur-Inkubator. Nach 48 Stunden werden die Vertiefungen mit einem Lichtmikroskop auf Organoidbildung überprüft.
Nach 7 Tagen Kultur saugen Sie das Nährmedium ab und ersetzen es durch eiskaltes DPBS. Verwenden Sie eine serologische 5-Milliliter-Pipette, um die Organoide und die extrazelluläre Matrixkugel mechanisch von der Platte zu lösen. Dann fassen Sie die Organoide in einem einzigen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zusammen.
Sammeln Sie die Organoide durch Zentrifugation und saugen Sie den Überstand bis zur Oberseite der sichtbaren ECM-Schicht ab. Suspendieren Sie das Pellet erneut in 15 Milliliter eiskaltem DPBS und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Nachdem Sie den Überstand wie gezeigt abgesaugt haben, suspendieren Sie das Pellet erneut in 1 Milliliter eiskaltem PBS und verwenden Sie eine P200-Pipette, um die intakten Organoide manuell aufzubrechen.
Bestätigen Sie eine vollständige Dissoziation der Organoide. Schleudern Sie die dissoziierten Organoide und suspendieren Sie sie erneut im erforderlichen Volumen der extrazellulären Matrix, bevor Sie sie auf eine frische 48-Well-Platte auftragen, wie gezeigt. Dann legen Sie die Platte für 5 Minuten zurück in den Inkubator.
Nach 5 Minuten nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Sie intestinale Basalmedien mit Wachstumsfaktoren und ROCK-Inhibitor hinzu. Wechseln Sie das Medium alle 2-4 Tage. Um eine Entzündungsreaktion in den Darmorganoiden auszulösen, ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung der Organoidkultur durch 300 Mikroliter frisch zubereitetes Basalmedium, ergänzt mit 40 Nanogramm pro Milliliter TNF alpha.
Dann legen Sie die Platte für 48 Stunden zurück in den Zellkultur-Inkubator, um eine entzündungsfördernde Umgebung zu replizieren. Die Genexpression kann im Verlauf der humanen IPSC-Differenzierung mit Hilfe von Pluripotenzmarkern überwacht werden, die am Tag 0 stark exprimiert werden und während des Prozesses der definitiven Endodermdifferenzierung schnell herunterreguliert werden. Am 2. Tag der Differenzierung sollten definitive Endoderm-Gene exprimiert werden, und die Expression sollte am 3. Tag ihren Höhepunkt erreichen.
Während der Hinterdarmspezifikation sollte die Expression von CDX2 und HNF4alpha induziert werden und im Laufe der Zeit zunehmen. 48 Stunden nach dem 2D-Zellblatttransfer sollten sich die Zellblätter automatisch zu kompakteren 3D-Sphäroidstrukturen organisieren, die zunächst klein sind, aber in den nächsten 7-10 Tagen der Kultur allmählich an Größe und Komplexität zunehmen. Die Organoide sollten erst dann durchgelassen werden, wenn sie eine klare Organoid-Sphäroid-Morphologie mit offensichtlichem Epithel erreicht haben und das Lumen zur Mitte der Struktur zeigt.
Wenn die Strukturen dieses Stadium erreichen, kann eine Immunzytochemie durchgeführt werden, um die Expression von Darmmarkern wie Villin und CDX2 zu bestätigen. Um eine Entzündung zu modellieren, kann TNF alpha für 24-48 Stunden in das Gewebekulturmedium gegeben werden, was typischerweise zur Expression von entzündungsfördernden Markern in Verbindung mit der Herunterregulierung von Darmepithelmarkern führt. Humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Darmorganoide können für die Arzneimittelforschung, die Krankheitsmodellierung, die Geneditierung, eine Untersuchung der Tumormikroumgebung sowie für das transkriptomische, proteomische und epigenetische Profil jeder Krankheit von Interesse verwendet werden.
Diese Methode kann vielen Laboren helfen, Darmorganoide als Modellsystem zu etablieren und ihnen eine zusätzliche Methode für ihre Forschung zu bieten.
