この方法では、最終内胚葉、後腸上皮、そして最後に3D培養条件への移行に分化することにより、ヒト誘導多能性幹細胞由来腸オルガノイドを生成する方法を段階的に説明します。ヒト人工多能性幹細胞由来の腸管オルガノイドから得られた結果は、単細胞培養のデータよりも優れた翻訳可能性を示すと同時に、長期培養が困難な初代組織由来オルガノイドよりも実用的です。分化したiPS細胞からヒト腸細胞を作製したら、5 mmリットルの血清ピペットを使用して、6ウェルプレートの各ウェルから細胞単層を剥離します。
そして、遠心分離のために細胞を15ミリリットルのチューブにプールします。成長因子を添加した腸内増殖培地にペレットを再懸濁します。そして、播種するウェルの数に応じて、適切な量の細胞外マトリックスを添加します。
30マイクロリットルの細胞懸濁液を、48ウェルプレートの適切な数のウェルの中央に加えます。ECMをウェルの中央に配置することは、そのサンプルの長期的な安定性にとって非常に重要です。ECMがウェルの壁に接触すると、ウェルが崩壊し、サンプルが失われる可能性があります。
プレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも5分間置きます。細胞外マトリックスが固まったら、成長因子を添加した300マイクロリットルの新鮮な腸内増殖培地を各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。48時間後、光学顕微鏡を使用して、オルガノイド形成についてウェルをチェックします。
7日間の培養後、培地を吸引し、氷冷したDPBSと交換します。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、オルガノイドと細胞外マトリックス球体をプレートから機械的に剥離します。次に、オルガノイドを1本の15ミリリットルの遠心チューブにプールします。
遠心分離によりオルガノイドを回収し、上清を目に見えるECM層の上部まで吸引します。ペレットを15ミリリットルの氷冷DPBSに再懸濁し、細胞を再度遠心分離します。上記のように上清を吸引した後、ペレットを1ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁し、P200ピペットを使用して無傷のオルガノイドを手動で破砕します。
オルガノイドの完全な解離を確認します。解離したオルガノイドをスピンし、必要な量の細胞外マトリックスに再懸濁してから、新しい48ウェルプレートに播種します。次に、プレートをインキュベーターに5分間戻します。
5分後、プレートをインキュベーターから取り出し、成長因子とROCK阻害剤を含む腸の基礎培地を追加します。2〜4日ごとにメディアを交換してください。腸オルガノイドで炎症反応を引き起こすには、オルガノイド培養の各ウェルの上清を、300マイクロリットルの新しく調製した基礎培地に40ナノグラム/ミリリットルのTNFアルファを添加したものに置き換えます。
次に、プレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻し、炎症誘発性環境を再現します。遺伝子発現は、0日目に高発現し、決定的な内胚葉分化の過程で急速にダウンレギュレーションされる多能性マーカーを使用して、ヒトIPSC分化の過程でモニターできます。分化の2日目に、決定的な内胚葉遺伝子が発現し始め、発現は3日目にピークに達するはずです。
後腸の指定中に、CDX2およびHNF4αの発現が誘導され、時間の経過とともに増加する必要があります。2D細胞シートの転写から48時間後、細胞シートは、最初は小さいが、次の7〜10日間の培養で徐々にサイズと複雑さが増す、より圧縮された3Dスフェロイド構造に自動組織化し始めるはずです。オルガノイドは、明らかな上皮と内腔が構造の中心を向いた明確なオルガノイドスフェロイド形態を達成するまで継代しないでください。
構造がこの段階に達すると、免疫細胞化学を行って、ビリンやCDX2などの腸マーカーの発現を確認できます。炎症をモデル化するために、TNFアルファを組織培養培地に24〜48時間添加することができ、その結果、通常、腸上皮マーカーのダウンレギュレーションと連動して炎症誘発性マーカーが発現します。ヒト人工多能性幹細胞由来腸オルガノイドは、創薬、疾患モデリング、遺伝子編集、腫瘍微小環境の研究、トランスクリプトームおよびプロテオミクス、およびあらゆる疾患のエピジェネティックプロファイルに使用できます。
この方法は、多くの研究室が腸管オルガノイドをモデルシステムとして確立するのに役立ち、研究のための新たな方法を提供します。
